發(fā)布時間：2022-01-02 07:17

　　漆酶（Laccase,EC 1.10.3.2）是一種含銅的多酚氧化酶,具有作用底物廣泛、產(chǎn)物無污染等優(yōu)點,在食品制造、紡織印染、生物傳感器等領域均具有極佳的應用潛力。漆酶同工酶LACC2和LACC6是阿魏蘑漆酶的主要組成成分,在阿魏蘑（Pleurotus eryngii var.ferulae）與膠紅酵母（Rhodotorulla mucilaginosa）共培養(yǎng)提高漆酶表達水平的過程中,LACC2和LACC6的基因轉錄水平分別發(fā)生明顯的上和下調。本論文圍繞LACC2和LACC6進一步展開酶學性質等方面的探究,為共培養(yǎng)促進漆酶生產(chǎn)的機理研究提供理論依據(jù)。主要研究結果如下:（1）將基因lacc2和lacc6分別與表達載體pPIC9K相連,轉化至畢赤酵母（Pichia pastoris）GS115感受態(tài)細胞中,獲得重組菌株P.pastoris GS115/pPIC9K-lacc2和P.pastoris GS115/pPIC9K-lacc6。通過對漆酶基因信號肽序列的切除以及誘導條件的優(yōu)化,得到具有高漆酶表達量的兩株重組菌株,酶活分別達到351.75 U·L^-1和857... 

【文章來源】：江南大學江蘇省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：51 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

提高漆酶表達水平的措施Figure1-1Strategiesforincreasingtheexpressionleveloflaccases

第二章材料與方法112.2.3大腸桿菌重組質粒的構建將基因片段sspoxa3a和sspoxa3b與表達載體pET28a分別經(jīng)EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切，16℃連接8~12h，構建重組質粒pET28a-sspoxa3a和pET28a-sspoxa3b并將其轉化至E.coliBL21感受態(tài)細胞。經(jīng)菌落PCR驗證，選擇片段大小正確的轉化子進行培養(yǎng)，提取質粒送至公司進行測序。整個構建流程如圖2-2所示。圖2-1畢赤酵母重組質粒的構建流程圖Figure2-1TheprocessofconstructingP.pastorisrecombinantvector

江南大學碩士學位論文122.2.4重組質粒的異源表達2.2.4.1重組質粒在畢赤酵母中的異源表達以下方法以重組質粒pPIC9K-lacc2和pPIC9K-lacc6的表達過程為例，重組質粒pPIC9K-sspoxa3a和pPIC9K-sspoxa3b的異源表達方式與之相同。（1）電轉化畢赤酵母利用StuI線性化空質粒pPIC9K、重組質粒pPIC9K-lacc2和pPIC9K-lacc6，并純化回收。提前參照文獻[75]的方法制備畢赤酵母GS115感受態(tài)，將線性化后的質粒分別電轉化到感受態(tài)細胞內，后培養(yǎng)2.5h再將菌液涂布于MD平板，30℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)36h。（2）高拷貝數(shù)重組菌的篩選從MD平板中隨機挑選出單菌落至帶有G418抗性的YPD平板上，并逐步提高G418濃度（0.25、1、2、4mg·mL-1）以篩選高拷貝數(shù)的轉化子。挑選在4mg·mL-1G418濃度的YPD平板上生長的酵母轉化子P.pastorisGS115/pPIC9K-lacc2和P.pastorisGS115/pPIC9K-lacc6，提取其基因組進行菌落PCR。（3）ABTS變性板的篩選將對照菌株P.pastorisGS115/pPIC9K，重組菌株P.pastorisGS115/pPIC9K-lacc2和P.pastorisGS115/pPIC9K-lacc6分別接種至提前添加了ABTS的BMMY平板上，在平皿蓋上滴加200μL甲醇，30℃培養(yǎng)箱中倒置且避光培養(yǎng)48h，觀察是否會有墨綠色的變色圈出現(xiàn)。（4）重組菌的誘導表達將篩得的重組菌株P.pastorisGS115/pPIC9K-lacc2、P.pastorisGS115/pPIC9K-lacc6和轉入了空質粒的對照組菌株P.pastorisGS115/pPIC9K接種至YPD液體培養(yǎng)基中，在30℃、250r·min-1的條件下培養(yǎng)24h。以3.0%的接種量轉接到BMGY培養(yǎng)基中，相同條件培養(yǎng)18h，以6000r·min-1的速度離心5min，收集菌體轉至BMMY培養(yǎng)基中，繼圖2-2大腸桿菌重組質粒的構建流程圖Figure2-2TheprocessofconstructingE.colirecombinantvector

【參考文獻】：
期刊論文
[1]真菌漆酶的性質、生產(chǎn)、純化及固定化研究進展[J]. 吳怡,馬鴻飛,曹永佳,司靜,崔寶凱.  生物技術通報. 2019(09)
[2]不同離子對漆酶酶活的影響[J]. 付林俊,劉海,張曉晴,張淑琴,任大軍.  化學試劑. 2019(08)
[3]Ganoderma sp.SYBC L48漆酶酶學性質及其對酸性紅1的脫色性能[J]. 竇欣,田喬鵬,王琦,管政兵,蔡宇杰,廖祥儒.  環(huán)境工程學報. 2019(04)
[4]肺炎克雷伯氏菌漆酶基因的克隆及其在畢赤酵母中的高效表達[J]. 王建玲,桂爽,付禹,張妤彤,鄭東,路福平,劉逸寒.  天津科技大學學報. 2019(01)
[5]菊粉外切酶的異源表達、純化及酶學性質[J]. 馬俊,安啟坤,唐文竹.  食品與發(fā)酵工業(yè). 2019(04)
[6]整體優(yōu)化的信號肽和人溶菌酶基因在畢赤酵母的高效表達[J]. 陳珊珊,丁健,李鑫,劉軍,賈祿強,槐強強,孫佼文,史仲平.  江蘇農業(yè)學報. 2018(01)
[7]短小芽孢桿菌LC01漆酶基因在畢赤酵母中的胞外表達及重組漆酶酶學性質研究[J]. 李成名,王佳懿,盧磊.  生物技術通報. 2018(03)
[8]白樺漆酶BpLAC1基因生物信息學分析[J]. 馮連榮,宋立志,趙大根,王玉成,池玉杰.  南方林業(yè)科學. 2017(03)
[9]黏細菌漆酶序列篩選及其重組酶酶學性質[J]. 趙秀艷,常飛,方澤民,張寅良,肖亞中.  生物工程學報. 2017(04)
[10]阿魏菇與膠紅酵母共培養(yǎng)產(chǎn)漆酶對活性艷藍W-RV的脫色[J]. 王寒,彭林,丁重陽,顧正華,張梁,石貴陽.  生物加工過程. 2015(05)

碩士論文
[1]竹林毛栓菌的誘變選育及其產(chǎn)酶條件優(yōu)化[D]. 繆曉磊.浙江農林大學 2019
[2]共培養(yǎng)膠紅酵母對阿魏蘑漆酶基因表達及其相關蛋白的影響[D]. 趙麗婷.江南大學 2017
[3]小菜蛾漆酶Ⅱ分子鑒定及其酶學特性[D]. 劉振剛.山東農業(yè)大學 2017
[4]平菇漆酶基因生物信息學分析和雜優(yōu)-2平菇漆酶分離純化及酶學性質、功能基團研究[D]. 廖海君.西南大學 2017
[5]信號肽、Kozak序列、N-糖基化對黑曲霉表達木聚糖酶的影響[D]. 王欣.東北農業(yè)大學 2016
[6]Pleurotus ferulae發(fā)酵產(chǎn)漆酶的研究[D]. 陳友枝.江南大學 2013



本文編號：3563735