蔗糖磷酸化酶（Sucrose phosphorylase,簡稱SPase）作為一種葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶,能夠以蔗糖為供體、葡萄糖為受體,通過轉(zhuǎn)苷反應(yīng)制備曲二糖。曲二糖具有促進(jìn)腸道益生菌生長、抑制α-葡萄糖苷酶活性及延緩碳水化合物消化吸收等功能,在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用潛力,通常采取SPase等合成曲二糖。然而,目前報(bào)道的SPase僅在大腸桿菌中異源表達(dá),并不適用于食品工業(yè)應(yīng)用,而枯草芽孢桿菌（B.subtilis）作為食品安全宿主則是表達(dá)SPase的更佳選擇。本研究首次將青春雙歧桿菌（Bifidobacterium adolescentis）來源的蔗糖磷酸化酶在B.subtilis WS11中異源表達(dá),研究了SPase作為一種天然胞內(nèi)酶卻被分泌至胞外的原因,并對其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究。在此基礎(chǔ)上,優(yōu)化重組酶制備曲二糖的工藝。此外,采用多種固定化載體對SPase進(jìn)行固定化,獲得了較好的固定化效果。主要研究結(jié)果如下:（1）構(gòu)建重組菌B.subtilis/pBSMuL3-SPase和B.subtilis/pHY300PLK-SPase,其中重組菌B.subtilis/pBSMuL3-SPase搖瓶... 

【文章來源】：江南大學(xué)江蘇省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：55 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

曲二糖結(jié)構(gòu)式Fig.1-1Structuresofkojibiose

(a) (b)圖 1-2 蔗糖磷酸化酶的晶體結(jié)構(gòu)(a): 蔗糖磷酸化酶結(jié)構(gòu)域；(b): 蔗糖磷酸化酶活性位點(diǎn)Fig. 1-2 Crystal structure of sucrose phosphorylase(a): the domains of sucrose phosphorylase; (b): the active site of sucrose phosphorylase其中，A 結(jié)構(gòu)域(1-85、167-291 和 356-435 位殘基)是存在于 GH13 家族的典型結(jié)構(gòu)β/ɑ)8桶結(jié)構(gòu)，由 8 個(gè)相互平行的 ɑ-螺旋和 β-折疊組成，含此結(jié)構(gòu)的酶的特性之一在于接螺旋到折疊的 loops 的平均長度要比連接折疊到螺旋的 loops 短。B 結(jié)構(gòu)域(86-166殘基)：主要是兩個(gè)短的 ɑ-螺旋和兩個(gè)反向平行的 β-折疊。B’結(jié)構(gòu)域(292-355 位殘基)要是盤繞區(qū)域，包含一個(gè)長 ɑ-螺旋和一個(gè)短 ɑ-螺旋，這種拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的存在，不利于寡的結(jié)合，同時(shí)減少了底物結(jié)合的通道，因此這個(gè)結(jié)構(gòu)域在調(diào)節(jié)酶功能上有重要意義。 結(jié)構(gòu)域：C 端的前 56 個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成一個(gè)五股反向平行的 β-折疊，這是 GH13 家其他成員中未發(fā)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)域。盡管完整的序列含有 2 個(gè)半胱氨酸(Cys)殘基，但并未在結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)二硫鍵，這是由于其中一個(gè) Cys356 殘基位于蛋白結(jié)構(gòu)的表面，且被氧化砜，而另一個(gè) Cys205 殘基位于酶內(nèi)部。二聚體的形成主要是兩個(gè) B 結(jié)構(gòu)域的相互作

圖 1-3 蔗糖磷酸化酶催化機(jī)理Fig. 1-3 Catalytic mechanism of sucrose phosphorylase磷酸化酶的催化機(jī)理如圖 1-3 所示，具體如下：ase 作用底物的相關(guān)活性位點(diǎn)，如上圖(A)所示；當(dāng)蔗糖進(jìn)入活性中心時(shí)，其葡即被 Glu232 質(zhì)子化，同時(shí)，Aspl92 親核進(jìn)攻葡萄糖基的異頭碳原子(B)；然-酶中間體，并釋放果糖(C)；隨后 loop A(336-344 位殘基)上的果糖結(jié)合位 移出，并由磷酸鹽結(jié)合位點(diǎn) Tyr344 取而代之，且 loop B(130-140)上的磷酸鹽Arg135 進(jìn)入活性部位，使得蔗糖-酶中間體與磷酸鹽(HPO42-或 H2PO4-)反應(yīng)，萄糖(D)；與相應(yīng)受體結(jié)合產(chǎn)生目的產(chǎn)物(E)。SPase 能可逆的催化蔗糖和磷酸糖和 D-葡萄糖-1-P。糖磷酸化酶的來源及應(yīng)用蔗糖磷酸化酶的來源磷酸化酶主要分布在細(xì)菌等微生物中，目前已經(jīng)報(bào)道的來源有：腸膜明串珠ostoc mesenteroides)[23-25]、長雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)[26, 27]、青春雙歧obacterium adolescentis，簡稱 B. adolescentis)[28]、巨大芽孢桿菌(Bac

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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碩士論文
[1]酶法轉(zhuǎn)化合成α-熊果苷的研究[D]. 張文蕾.江南大學(xué) 2017
[2]長雙歧桿菌蔗糖磷酸化酶在大腸桿菌中的表達(dá)及發(fā)酵優(yōu)化[D]. 葉慧.浙江大學(xué) 2015
[3]脂肪酶固定化及其在催化合成乙酸香茅酯中的應(yīng)用研究[D]. 候麗云.揚(yáng)州大學(xué) 2013
[4]蔗糖磷酸化酶的克隆表達(dá)及固定化[D]. 張奧.杭州師范大學(xué) 2013
[5]固定化纖維素酶的制備及其性質(zhì)研究[D]. 郭銳.天津大學(xué) 2009



本文編號：3468523