類脂A是脂多糖的重要活性成分,其結(jié)構(gòu)的變化將影響革蘭氏陰性菌細(xì)胞外膜性質(zhì),從而導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性和毒力的變化。磷酸乙醇胺轉(zhuǎn)移酶（EptA）是類脂A的結(jié)構(gòu)修飾酶。磷酸乙醇胺基團(tuán)的修飾使得類脂A上負(fù)電荷減少,從而中和了細(xì)菌表面的電負(fù)性。這一修飾使得多肽類抗生素與細(xì)菌外膜結(jié)合能力降低,則機(jī)體對革蘭氏陰性菌的自身免疫降低。大腸桿菌為重要的模式菌株,構(gòu)建大腸桿菌磷酸乙醇胺轉(zhuǎn)移酶缺失菌株便于研究腦膜炎奈瑟氏菌和阪崎腸桿菌的磷酸乙醇胺轉(zhuǎn)移酶。通過耐藥性實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探索磷酸乙醇胺轉(zhuǎn)移酶影響的細(xì)菌耐藥性機(jī)制以及細(xì)菌的致病機(jī)理。本課題的主要研究結(jié)論如下:（1）通過比對Neisseria meningitidis MC58和E.coli BL21（DE3）磷酸乙醇胺轉(zhuǎn)移酶EptA的同源性,在Neisseria meningitidis MC58中發(fā)現(xiàn)EptA編碼基因NMB_RS08540,并命名為NmeptA.構(gòu)建E.coli BL21（DE3）ΔeptA突變菌株,E.coli BL21（DE3）ΔeptA/pET28a-NmEptA表達(dá)菌株,發(fā)現(xiàn)E.coli BL21（DE3）EptA和... 

【文章來源】：江南大學(xué)江蘇省 211工程院校 教育部直屬院校

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【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

大腸桿菌類脂A的合成途徑及PEA修飾Fig.1-1TheconstitutivepathwayofE.colilipidAbiosynthesisandPEAmodification類脂的修飾

第一章緒論3滅細(xì)菌[20,21]。細(xì)菌進(jìn)行類脂A正電基團(tuán)的修飾，將會增強(qiáng)抵抗陽離子抗菌肽的能力。類脂A上的正電荷修飾也是革蘭氏陰性菌獲得性多肽類抗生素耐藥性的主要原因。革蘭氏陰性菌獲得性多肽類抗生素耐藥性是由特殊環(huán)境下PhoP/PhoQ二元調(diào)控系統(tǒng)釋放PmrD，從而激活PmrAB調(diào)控系統(tǒng)，使得arn系列操縱子被激活，從而進(jìn)行類脂A的正電修飾（圖1-2）[15,22,23]。根據(jù)文獻(xiàn)已知，弗朗西斯菌中的類脂A上1"和4"位上的磷酸基團(tuán)分別能夠被LpxE、LpxF磷酸酶選擇性地去除。沙門氏菌中首先發(fā)現(xiàn)氨基阿拉伯糖轉(zhuǎn)移酶（ArnT），類脂A上1"和4"位的磷酸基團(tuán)能夠在該酶的作用下加上氨基阿拉伯糖基團(tuán)[24,25]。在弱酸性或在高鎂離子等環(huán)境中，大腸桿菌以及阪崎腸桿菌中磷酸乙醇胺轉(zhuǎn)移酶（EptA）表達(dá)，磷酸乙醇胺基團(tuán)在該酶的作用下被特異性地加到在類脂A上1"和4"位上的磷酸上[26]。另外，與類脂A正負(fù)電荷修飾相關(guān)的酶還有LmtA、LpxT和EptB等[27]。類脂A分子形狀的改變主要是依靠脂肪酸鏈數(shù)目和長度來改變。有文獻(xiàn)指出，類脂A分子的形狀可能與TLR4的識別有關(guān)。在沙門氏菌中，PagL和PagP分別將C3"位上的羥基脂肪酸鏈和C2"位上C16:0脂肪酸鏈去除[28]。大腸桿菌和阪崎腸桿菌中，類脂A在LpxM的作用下將增C12:0或者C14:0的酰基脂肪酸鏈。同時(shí)，在鼠疫桿菌類脂A中含6條脂肪酸鏈的菌體能夠激活TLR4通路，而含4條脂肪酸鏈的菌體無法激活該通路。這也說明類脂A脂肪酸鏈的數(shù)目與其感染能力相關(guān)。圖1-2革蘭氏陰性菌獲得性多肽類抗生素耐藥性機(jī)制[23]Fig.1-2ThemechanismofGram-negativebacteriaacquiredpeptideantibioticresistance.1.2磷酸乙醇胺轉(zhuǎn)移酶磷酸乙醇胺轉(zhuǎn)移酶（EptA）是類脂A的正電修飾酶。EptA修飾類脂A上1"或者4"的磷酸基團(tuán)，使得類脂A的負(fù)電荷減少，從而使得細(xì)?

?eptA基因進(jìn)行同源性比對，結(jié)果得出NMB_RS08540與eptA的同源性在38.54%，且該基因是由1638bp核苷酸組成編碼的氨基酸序列。NMB_RS10465與eptA的同源性在37.66%，由1578bp核苷酸組成編碼的氨基酸。找到各自下游的兩個(gè)基因，分別與E.coli中pmrA和pmrB基因進(jìn)行比對，見圖3-1。NMB_RS08540下游基因?yàn)镹MB_RS08535和NMB_RS08530，與pmrA和pmrB同源性為37.26%和25.64%。而NMB_RS10465僅有下游基因NMB_RS10470，該基因與pmrA同源性為8.91%。從兩個(gè)基因與E.coli中eptA基因DNA同源性和蛋白同源性來看，NMB_RS08540為eptA的同源基因。圖3-1E.coli和NeisseriameningitidisMC58中磷酸乙醇胺修飾相關(guān)基因位置的比較Fig.3-1ThepositionofpEtNphosphotransferasesrelativegenesinE.coliandNeisseriameningitidisMC583.1.2E.coliBL21(DE3)ΔeptA構(gòu)建和磷酸乙醇胺轉(zhuǎn)移酶表達(dá)為驗(yàn)證NMB_RS08540基因功能，本研究對E.coliBL21(DE3)的eptA基因進(jìn)行敲除，并將eptA進(jìn)行回補(bǔ)表達(dá)，CseptA以及NMB_RS08540進(jìn)行異源表達(dá)表達(dá)等改造，通過質(zhì)譜進(jìn)一步確定其功能。利用Jiang等的基因敲除方法[49]，在E.coliBL21(DE3)的染色體上進(jìn)行eptA基因的

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]細(xì)菌類脂A的結(jié)構(gòu)修飾及其應(yīng)用前景[J]. 陳久洲,李燁,王小元.  微生物學(xué)通報(bào). 2010(11)
[2]細(xì)菌類脂A結(jié)構(gòu)與功能研究進(jìn)展[J]. 李顏顏,史鋒,李燁,王小元.  微生物學(xué)報(bào). 2008(06)

碩士論文
[1]阪崎克羅諾腸桿菌類脂A磷酸乙醇胺轉(zhuǎn)移酶相關(guān)基因的鑒定[D]. 劉璐.江南大學(xué) 2017
[2]合成不同結(jié)構(gòu)類脂A分子的大腸桿菌的構(gòu)建[D]. 韓雅寧.江南大學(xué) 2013
[3]大腸桿菌中類脂A分子結(jié)構(gòu)的定向改造[D]. 陳久洲.江南大學(xué) 2010



本文編號：3389516