γ-氨基丁酸（GABA）是一種廣泛存在于植物、動物和微生物體內的非蛋白質氨基酸,具有降血壓、抗焦慮、調節(jié)激素分泌等多種生理功能,在食品、醫(yī)藥和化工領域都有很重要的應用價值。谷氨酸脫羧酶（GAD）通過脫羧作用將谷氨酸（Glu）轉化為GABA。因此,篩選高比酶活力的谷氨酸脫羧酶突變體并建立相應的高密度發(fā)酵工藝具有重要的意義。首先,建立了谷氨酸脫羧酶突變體的高通量篩選體系。根據(jù)全細胞轉化Glu生成GABA過程中的pH變化規(guī)律,選擇氯酚紅-溴甲酚綠鈉酸堿指示劑,確立指示劑比例為1:1,篩選濃度為0.6%（v/v）,Glu底物濃度為10g/L的顯色體系,建立了抗性平板初篩,深孔板培養(yǎng)單菌落,96孔板轉化,酶標儀OD575/OD600掃描比對分析,搖瓶復篩的高通量篩選體系。其次,獲得了Glu轉化效率提高的工程菌。通過易錯PCR技術構建GAD突變體文庫,利用構建的篩選體系獲得三株轉化效率提高且耐熱性改善的工程菌。菌株BW（△C）/PYB1 S-L bgadBV209V/T237S/C379C/V406V在55℃條件下孵育3 h后,轉化（45℃）400 g/L Glu,反應4 h時GABA的含量達到2... 

【文章來源】：福建師范大學福建省

【文章頁數(shù)】：89 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖１－１全細胞催化過程ｐＨ變化??Ｆｉｇ．?１－１?Ｃｈａｎｇｅ?ｏｆ?ｐＨ?ｉｎ?ｗｈｏｌｅ?－Ｃｅｌｌ?Ｃａｔａｌｙｔｉｃ?ｐｒｏｃｅｓｓ??

福建師范大學魏杰碩士學位論文??圖１－１表示全細胞催化過程中的ｐＨ變化，轉化初始ｐＨ在３．４左右，前半小時??ｐＨ上升很快是因為體系內谷氨酸開始轉化為中性的ＧＡＢＡ，而體系內的谷氨酸溶??解度很低，從而使ｐＨ上升很快，當體系中的ｐＨ上升至４．２－５．０之間時，上升趨勢??減緩是因為此時的ｐＨ處于ＧＡＤ的活性最適ｐＨ范圍，谷氨酸的轉化速率和ＧＡＢＡ??合成速率不斷加快，本實驗室前期的實驗研宄表明ＧＡＢＡ有促進谷氨酸溶解的作??用，因此體系中谷氨酸的轉化速率和溶解速率相互中和，當ｐＨ上升至５．０后上升趨??勢加快然后趨于平緩，是因為處于轉化后期，體系中的谷氨酸完全溶解并且含量逐??漸減少，此時ＧＡＤ的活力逐漸喪失，導致谷氨酸基本轉化不動，反應速率下降，??ｐＨ上升緩慢

Ｆｉｇ．?１－６?Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ?ｏｆ?Ｉｎｄｉｃａｔｏｒ?ｒａｔｉｏ??Ａ：?Ｃｈａｎｇｅ?ｏｆ?ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ?ｏｆ?ｉｎｄｉｃａｔｏｒ?Ｂ：?Ｃｈａｎｇｅ?ｏｆ?Ｃｏｌｏｒ?ｏｆ?ｉｎｄｉｃａｔｏｒ??由圖１－６Ｂ可知，不同比例的指示劑的顏色在不同ｐＨ下的變化有明顯區(qū)別。當??ｐＨ升高至５．２以后，溴甲酚綠鈉指示劑的比例增加使顏色偏向于藍色，并且變化很??小，當氯酚紅指示劑的比例增加吋，顏色偏向于紅色；當ｐＨ＜３．７時，各比例指示??劑顏色都為黃色，說明該指示劑在ｐＨ?３．７以上才有顏色變化；ｐＨ在４．７－５．２之間時，??處于轉化過程ｐＨ轉折點（ｐＨ?５．０），指示劑比例為１：１時顏色由藍綠色到深藍色再??到紫色，而其他比例的指示劑在這一區(qū)間顏色變化不明顯。圖Ａ為不同比例指示劑??在５７５?ｎｍ下的吸光度（全波長掃描各比例指不劑的最大吸收波長均為５７５?ｎｍ），??指示劑比例為１：１時的吸光度值變化最大，其它比例的指示劑吸光度值變化較小，??因此選擇氯酚紅－溴甲酚綠鈉指示劑的比例為１：１

【參考文獻】：
期刊論文
[1]普魯蘭酶突變體文庫高通量篩選方法的建立及應用[J]. 聶簡琪,陳阿娜,劉秀霞,楊艷坤,白仲虎.  食品與生物技術學報. 2016(09)
[2]飽和定點突變拓寬谷氨酸脫羧酶催化pH范圍的研究[J]. 林玲,胡升,郁凱,黃俊,梅樂和.  高校化學工程學報. 2014(06)
[3]采用易錯PCR對粘質沙雷氏菌幾丁質酶C進行定向進化[J]. 劉治江,賀淹才,李紅然,劉嘉,施騰鑫.  華僑大學學報(自然科學版). 2010(01)
[4]γ-氨基丁酸控制哮喘急性發(fā)作臨床療效觀察[J]. 徐傳偉,夏應和,鄭振文,張向前.  濱州醫(yī)學院學報. 1999(02)
[5]γ-氨基丁酸的發(fā)現(xiàn)史[J]. 葉惟泠.  生理科學進展. 1986(02)

碩士論文
[1]轉化法合成γ-氨基丁酸的霉菌篩選及條件優(yōu)化[D]. 田東亮.齊魯工業(yè)大學 2013
[2]微生物細胞催化合成γ-氨基丁酸（GABA）的研究[D]. 韓雪.哈爾濱商業(yè)大學 2013



本文編號：3233406