發(fā)布時(shí)間：2021-06-14 02:17

　　絲狀真菌由于具有與細(xì)菌、酵母不同的獨(dú)特優(yōu)點(diǎn):具有與高等真核生物類似的很強(qiáng)的蛋白外分泌能力,能夠進(jìn)行正確的各種翻譯后加工,因此被廣泛應(yīng)用于外源蛋白的高效表達(dá)。其中黑曲霉有較高的安全性可以被用于食品藥品等領(lǐng)域,成為研究的熱點(diǎn)。工業(yè)用脂肪酶的重要來源之一是微生物來源的脂肪酶,本實(shí)驗(yàn)室篩選到的一株產(chǎn)脂肪酶的米曲霉菌株WZ007,其脂肪酶基因aol（Gen Bank:KP975533）已成功在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)和巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)。為了進(jìn)一步提高的米曲霉脂肪酶基因的表達(dá),本課題嘗試?yán)棉r(nóng)桿菌介導(dǎo)的真菌表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)其在黑曲霉中胞外分泌表達(dá),并對其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究,研究結(jié)果如下:1、表達(dá)米曲霉脂肪酶基因的黑曲霉工程菌的構(gòu)建。首先將米曲霉脂肪酶aol目的基因與p CAMBIA-Pgpd A-Tcbh1-hph-Ptrp C載體連接并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E.coli DH5α,篩選出陽性轉(zhuǎn)化子。轉(zhuǎn)化子測序驗(yàn)證后再提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌AGL-1感受態(tài)細(xì)胞,再PCR鑒定陽性轉(zhuǎn)化子。將黑曲霉孢子懸浮液與農(nóng)桿菌于22℃共培養(yǎng)48 h,隨后轉(zhuǎn)移到潮霉素B抗性篩選培養(yǎng)基,獲得的黑曲霉陽性轉(zhuǎn)化子,提取轉(zhuǎn)化子的基因... 

【文章來源】：浙江工業(yè)大學(xué)浙江省

【文章頁數(shù)】：82 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

AOL基因PCR驗(yàn)證電泳圖

米曲霉脂肪酶在黑曲霉中的表達(dá)研究21因。圖2-2HPH基因PCR驗(yàn)證電泳圖Fig.2-2Verificationelectrophoresismapofhph泳道M：DL2000Marker;泳道1、2、3和4:hph抗性.以載體pCAMBIA-PgpdA-Tcbh1-hph-PtrpC為模板基因進(jìn)行載體反向PCR，1.0%瓊脂糖凝膠電泳如圖2-3，條帶大小在10000bp左右，大小正確。圖2-3載體pCAMBIA-PgpdA-Tcbh1-hph-PtrpC基因PCR驗(yàn)證電泳圖Fig.2-3VerificationelectrophoresismapofvectorpCAMBIA-PgpdA-Tcbh1-hph-PtrpC泳道M：2KplusⅡMarker;泳道1和2:載體基因

米曲霉脂肪酶在黑曲霉中的表達(dá)研究21因。圖2-2HPH基因PCR驗(yàn)證電泳圖Fig.2-2Verificationelectrophoresismapofhph泳道M：DL2000Marker;泳道1、2、3和4:hph抗性.以載體pCAMBIA-PgpdA-Tcbh1-hph-PtrpC為模板基因進(jìn)行載體反向PCR，1.0%瓊脂糖凝膠電泳如圖2-3，條帶大小在10000bp左右，大小正確。圖2-3載體pCAMBIA-PgpdA-Tcbh1-hph-PtrpC基因PCR驗(yàn)證電泳圖Fig.2-3VerificationelectrophoresismapofvectorpCAMBIA-PgpdA-Tcbh1-hph-PtrpC泳道M：2KplusⅡMarker;泳道1和2:載體基因

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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[3]基于RNAi抗PRSV番木瓜株系的培育及其分子特征驗(yàn)證[J]. 黃靜,賈瑞宗,孔華,郭靜遠(yuǎn),王緒朋,郭安平.  熱帶作物學(xué)報(bào). 2017(03)
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[6]根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)脂肪酶在無孢黑曲霉中的高效表達(dá)[J]. 潘力,王云艷,王斌,何攀,李俊星.  華南理工大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版). 2012(05)
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博士論文
[1]米曲霉脂肪酶的分離純化、基因克隆、表達(dá)及其在維生素A合成中的應(yīng)用研究[D]. 鄭建永.浙江工業(yè)大學(xué) 2015

碩士論文
[1]白曲霉酸性蛋白酶在無孢黒曲霉SH-2中的表達(dá)研究[D]. 董文超.華南理工大學(xué) 2018
[2]基于CRISPR系統(tǒng)的絲狀真菌基因組快速編輯[D]. 李丹丹.福州大學(xué) 2017
[3]產(chǎn)脂肪酶Aspergillus oryzae WZ007的誘變選育及其酶的分離純化[D]. 劉虹才.浙江工業(yè)大學(xué) 2012
[4]微生物酶法制備芳氧苯氧丙酸酯類除草劑關(guān)鍵手性中間體的研究[D]. 姚俠.浙江工業(yè)大學(xué) 2012
[5]產(chǎn)脂肪酶菌株Aspergillus oryzae WZ007的誘變及其發(fā)酵條件的優(yōu)化與應(yīng)用[D]. 徐瑋.浙江工業(yè)大學(xué) 2012
[6]細(xì)胞膜電穿孔現(xiàn)象機(jī)理研究[D]. 肖華娟.中國科學(xué)院研究生院（電工研究所） 2004



本文編號(hào)：3228850