L-精氨酸作為一種重要的工業(yè)氨基酸,廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品及動物飼料等領(lǐng)域。作為天然氨基酸中N:C比例最高的氨基酸,其合成與氮源吸收及利用密切相關(guān)。本研究以谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum）和高產(chǎn)L-精氨酸的鈍齒棒桿菌（Corynebacterium crenatum）作為出發(fā)菌株,研究氮代謝PⅡ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白GlnK在氮調(diào)控及L-精氨酸合成中的作用,通過蛋白互作挖掘GlnK在L-精氨酸合成中的調(diào)控靶點,探究GlnK與其靶蛋白結(jié)合的生理意義,結(jié)合分子模擬及定點突變鑒定復(fù)合體的關(guān)鍵結(jié)合位點,最終解析清楚GlnK在L-精氨酸合成中的調(diào)控機制。主要研究內(nèi)容如下:（1）比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析高低氮源濃度對鈍齒棒桿菌胞內(nèi)蛋白表達水平及代謝進程的影響發(fā)現(xiàn),在低氮條件下,氮代謝相關(guān)蛋白的表達水平顯著上調(diào),其中GlnK表達量上調(diào)4.11倍;并且受氮源濃度影響表達差異顯著蛋白主要集中在氨基酸代謝途徑,表明氮調(diào)控相關(guān)蛋白與氨基酸合成可能存在聯(lián)系,尤其是氮代謝信號蛋白GlnK。（2）構(gòu)建glnK過表達、敲除及弱化菌株,探究GlnK對鈍齒棒桿菌氮代謝及L-精氨酸合成的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),... 

【文章來源】：江南大學(xué)江蘇省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：58 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 緒論
    1.1 L-精氨酸的概述
        1.1.1 L-精氨酸的結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)
        1.1.2 L-精氨酸的生理功能及生產(chǎn)方法
        1.1.3 棒桿菌中L-精氨酸的合成途徑
    1.2 棒桿菌中氮代謝調(diào)控與L-精氨酸合成的關(guān)系
    1.3 PⅡ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的研究進展
        1.3.1 PⅡ蛋白超家族的特性分析
        1.3.2 PⅡ蛋白在氮代謝中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制
    1.4 論文立題依據(jù)與研究意義
    1.5 論文研究思路與主要內(nèi)容
第二章 材料與方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 菌種與質(zhì)粒
        2.1.2 引物
    2.2 實驗試劑和儀器
        2.2.1 主要實驗試劑
        2.2.2 相關(guān)試劑的配制
        2.2.3 實驗儀器
    2.3 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件
    2.4 實驗方法
        2.4.1 染色體基因組DNA的提取與質(zhì)粒DNA的提取
        2.4.2 大腸桿菌感受態(tài)與棒桿菌電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞的制備
        2.4.3 重組大腸桿菌及棒桿菌的構(gòu)建
        2.4.4 重組菌目的蛋白的過表達及純化
        2.4.5 同源重組敲除技術(shù)
        2.4.6 比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析
        2.4.7 突變質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.4.8 RNA的抽提和RT-q PCR
        2.4.9 重組鈍齒棒桿菌的酶活檢測
        2.4.10 蛋白互作GST pull-down實驗分析
        2.4.11 Western Blot分析
        2.4.12 等溫滴定量熱法(ITC)測定蛋白與底物的結(jié)合
        2.4.13 L-精氨酸的反饋抑制實驗
        2.4.14 蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)模擬及多序列比對
        2.4.15 分子對接與分子動力學(xué)模擬分析方法
        2.4.16 離子色譜檢測NH4+的濃度
        2.4.17 整合突變
        2.4.18 氨基酸測定方法
        2.4.19 L-精氨酸的檢測
第三章 結(jié)果與討論
    3.1 比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析不同氮源濃度下鈍齒棒桿菌中差異顯著蛋白
        3.1.1 氮代謝相關(guān)蛋白及L-精氨酸合成相關(guān)蛋白的表達水平分析
        3.1.2 差異蛋白的功能富集
    3.2 鈍齒棒桿菌中PⅡ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白Gln K對 L-精氨酸合成的影響
        3.2.1 過表達GlnK菌株的構(gòu)建
        3.2.2 GlnK缺失菌株的構(gòu)建
        3.2.3 CRISPRi系統(tǒng)的構(gòu)建及弱化Gln K菌株的構(gòu)建
        3.2.4 Gln K對 NH4+吸收的影響
        3.2.5 GlnK對氮代謝及L-精氨酸合成相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響
        3.2.6 GlnK對氮代謝及L-精氨酸合成關(guān)鍵酶酶活的影響
        3.2.7 GlnK對各種氨基酸合成的影響
        3.2.8 Cc-gln K,Cc-?gln K及 Cc-kd/gln K產(chǎn) L-精氨酸性能比較
    3.3 鈍齒棒桿菌中PⅡ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白Gln K調(diào)控靶點的鑒定
        3.3.1 GlnK同源序列比對
        3.3.2 ITC驗證Gln K蛋白與其效應(yīng)分子ATP及 ADP的結(jié)合
        3.3.3 鈍齒棒桿菌全細(xì)胞范圍內(nèi)GlnK蛋白調(diào)控靶點的鑒定
        3.3.4 GST pull-down驗證Gln K蛋白與氮轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Amt R的結(jié)合
        3.3.5 GST pull-down驗證Gln K蛋白與N-乙酰谷氨酸激酶的結(jié)合
    3.4 谷氨酸棒桿菌中Gln K-NAGK互作生理意義探究及結(jié)合方式鑒定
        3.4.1 Gln K蛋白緩解NAGK受 L-精氨酸反饋抑制程度的測定
        3.4.2 Gln K與 NAGK蛋白分子對接及分析
        3.4.3 Gln K與 NAGK復(fù)合體分子動力學(xué)分析
    3.5 谷氨酸棒桿菌中Gln K-NAGK復(fù)合體關(guān)鍵結(jié)合位點的解析
        3.5.1 NAGK同源序列比對
        3.5.2 Gln K與 NAGK關(guān)鍵突變位點的選擇
        3.5.3 Gln K與 NAGK突變株的構(gòu)建及表達純化
        3.5.4 突變后Gln K與 NAGK結(jié)合情況的測定
        3.5.5 Gln K及 NAGK突變體對NAGK反饋抑制作用的影響
        3.5.6 分子動力學(xué)分析Gln K突變體對Gln K-NAGK復(fù)合體的影響
        3.5.7 整合突變改造GlnK蛋白對L-精氨酸產(chǎn)量的影響
主要結(jié)論和展望
    主要結(jié)論
    展望
致謝
參考文獻
附錄:作者在攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文


【參考文獻】：
期刊論文
[1]雙功能尿苷酰轉(zhuǎn)移/去除酶GlnD在谷氨酸棒桿菌JNR中的功能[J]. 李靜,徐美娟,舒群峰,趙雅雯,唐蜜,張顯,楊套偉,許正宏,饒志明.  微生物學(xué)報. 2019(11)
[2]L-精氨酸的理化性質(zhì)、生理功能及生產(chǎn)工藝研究進展[J]. 王哲,周巖民.  飼料研究. 2014(13)
[3]鈍齒棒桿菌N-乙酰鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶的克隆表達分析及其重組菌的精氨酸發(fā)酵[J]. 徐美娟,張顯,饒志明,楊娟,竇文芳,金堅,許正宏.  生物工程學(xué)報. 2011(07)
[4]高產(chǎn)精氨酸的鈍齒棒桿菌在高低供氧條件下的差異蛋白質(zhì)組學(xué)初步研究[J]. 陶帥,竇文芳,張曉梅,許泓瑜,饒志明,許正宏.  化工學(xué)報. 2011(06)
[5]L-精氨酸發(fā)酵研究進展[J]. 王霞,陶文沂,孫志浩,許正宏.  工業(yè)微生物. 2000(04)

博士論文
[1]鈍齒棒桿菌SYPA5-5發(fā)酵產(chǎn)L-精氨酸的代謝工程改造[D]. 徐美娟.江南大學(xué) 2012

碩士論文
[1]鈍齒棒桿菌SYPH5-8合成L-精氨酸的代謝工程改造[D]. 趙芹芹.江南大學(xué) 2014



本文編號：3183174