發(fā)布時間：2021-05-07 11:20

　　番茄紅素和β-胡蘿卜素是應用最廣泛的兩種類胡蘿卜素。番茄紅素是類胡蘿卜素中最強的單線態(tài)氧猝滅劑,β-胡蘿卜素是人體維生素A的重要前體。二者不但具有鮮艷的紅、橙色澤,更重要的是其具有抗氧化和抗腫瘤等特性。因此,番茄紅素和β-胡蘿卜素被廣泛應用于功能食品、醫(yī)藥保健和化妝品等領域,國際市場需求日益擴增。類球紅細菌,屬于光合細菌,是研究光合作用和膜蛋白的模式微生物。隨著其遺傳操作方法的成熟和代謝工程技術的發(fā)展,類球紅細菌已成功用于多種高附加值化合物的生產。相比于傳統的類胡蘿卜素生產宿主,類球紅細菌具有許多天然的優(yōu)勢。首先,類球紅細菌本身含有類胡蘿卜素合成基因簇,內含七個類胡蘿卜素合成基因,能天然積累多種類胡蘿卜素。其次,類球紅細菌具有豐富的內膜系統,這非常有利于類胡蘿卜素在膜上的大量積累。此外,類球紅細菌可以在厭氧條件下合成類胡蘿卜素,這對于微生物發(fā)酵來說非常關鍵,因為厭氧可以實現低碳損,降低生產成本。因此,本研究擬采用類球紅細菌作為底盤細胞工廠,通過代謝工程改造,實現類球紅細菌生物合成番茄紅素和β-胡蘿卜素。主要研究內容和結果如下:（1）在類球紅細菌中構建番茄紅素合成途徑。我們選用深紅紅螺菌... 

【文章來源】：陜西師范大學陜西省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數】：96 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
中英文縮略詞對照表
第1章 緒論
    1.1 番茄紅素和β-胡蘿卜素簡介
        1.1.1 番茄紅素的理化性質、生理功能及應用
        1.1.2 β-胡蘿卜素的理化性質、生理功能及應用
    1.2 番茄紅素和β-胡蘿卜素的生產方法及現狀
        1.2.1 植物提取
        1.2.2 化學合成
        1.2.3 微生物發(fā)酵
    1.3 微生物合成番茄紅素和β-胡蘿卜素的研究進展
        1.3.1 天然合成類胡蘿卜素的微生物的研究進展
        1.3.2 異源合成類胡蘿卜素的工程菌株的研究進展
    1.4 代謝工程的研究進展
        1.4.1 調節(jié)中心代謝途徑
        1.4.2 提高MEP途徑的代謝通量
    1.5 類球紅細菌
        1.5.1 類球紅細菌的研究及其應用
        1.5.2 類球紅細菌的接合轉移及其原理
    1.6 本課題的研究目的、意義和內容
        1.6.1 本課題的研究目的、意義
        1.6.2 研究內容
第2章 類球紅細菌中番茄紅素生物合成途徑的構建
    2.1 引言
    2.2 實驗材料
        2.2.1 菌種、質粒和引物
        2.2.2 分子實驗所用的試劑盒和酶類
        2.2.3 主要實驗化學試劑
        2.2.4 培養(yǎng)基及抗生素
        2.2.5 主要實驗儀器和設備
    2.3 實驗內容和方法
        2.3.1 類球紅細菌和深紅紅螺菌的培養(yǎng)及其基因組的提取
        2.3.2 大腸桿菌的培養(yǎng)及質粒的提取
        2.3.3 細菌生長檢測及保存
        2.3.4 目的DNA片段的PCR擴增
        2.3.5 瓊脂糖凝膠電泳及DNA回收
        2.3.6 質粒的酶切與連接
        2.3.7 大腸桿菌DH5a和S17-1感受態(tài)的制備及其熱激轉化
        2.3.8 雙親接合轉移方法及其優(yōu)化實驗
        2.3.9 類球紅細菌及其工程菌株的發(fā)酵培養(yǎng)
        2.3.10 類球紅細菌及其工程菌株類胡蘿卜素的提取與分析
    2.4 結果與分析
        2.4.1 雙親接合轉移最優(yōu)條件的選擇
        2.4.2 八氫番茄紅素四步脫氫酶CrtI_4的選擇
        2.4.3 替換質粒pK18-△crtI_3::crtI_4的構建
        2.4.4 深紅紅螺菌的crtI_4基因替換類球紅細菌自身的crtI_3基因
        2.4.5 敲除質粒pK18-△crtC的構建
        2.4.6 番茄紅素工程菌株RL1的篩選及鑒定
        2.4.7 番茄紅素工程菌株RL1發(fā)酵液中番茄紅素的定量分析
    2.5 本章小結
第3章 敲除中心代謝途徑關鍵基因zwf和整合表達MEP途徑限速基因dxs提高番茄紅素的產量
    3.1 引言
    3.2 實驗材料
        3.2.1 菌種、質粒和引物
        3.2.2 分子實驗所用的試劑盒和酶類
    3.3 實驗內容和方法
    3.4 實驗結果與分析
        3.4.1 敲除質粒pK18-△zwf質粒的構建
        3.4.2 番茄紅素工程菌株RL2的篩選及鑒定
        3.4.3 替換質粒pK18-△zwf::dxs的構建
        3.4.4 番茄紅素工程菌株RL3的篩選及鑒定
        3.4.5 敲除zwf與整合表達dxs分別對番茄紅素合成的影響
    3.5 本章小結
第4章 番茄紅素工程菌株代謝機制及其發(fā)酵產物的定性
    4.1 引言
    4.2 實驗材料
        4.2.1 菌種、質粒和引物
        4.2.2 分子實驗所用的試劑盒和酶類
        4.2.3 主要實驗化學試劑
        4.2.4 主要儀器和設備
    4.3 實驗內容和方法
        4.3.1 類球紅細菌總RNA的提取
        4.3.2 實時熒光定量PCR
        4.3.3 培養(yǎng)基中葡萄糖含量的檢測
        4.3.4 番茄紅素的純化結晶方法
        4.3.5 紅外光譜檢測方法
        4.3.6 核磁共振檢測方法
    4.4 結果與分析
        4.4.1 番茄紅素工程菌株相關基因轉錄水平對番茄紅素含量的影響
        4.4.2 番茄紅素工程菌株RL3的發(fā)酵過程分析
        4.4.3 番茄紅素的分離純化
        4.4.4 紅外光譜測定結果
        4.4.5 核磁共振測定結果
    4.5 本章小結
第5章 類球紅細菌中β-胡蘿卜素生物合成途徑的初步構建
    5.1 引言
    5.2 實驗材料
        5.2.1 菌種、質粒和引物
        5.2.2 培養(yǎng)基及抗生素
    5.3 實驗內容和方法
        5.3.1 成團泛菌的培養(yǎng)及其基因組DNA的提取
        5.3.2 β-胡蘿卜素的定量分析
    5.4 結果與分析
        5.4.1 替換質粒pK18-△crtI_3::crtY~(pa)I~(pa)的構建
        5.4.2 利用成團泛菌來源的crtI~(pa)Y~(pa)分別在RL1和RL3中構建β-胡蘿卜素生物合成途徑
        5.4.3 β-胡蘿卜素工程菌株的HPLC定量分析
    5.5 本章小結
第6章 結論與展望
    6.1 結論
    6.2 展望
參考文獻
致謝
攻讀碩士學位期間研究成果


【參考文獻】：
期刊論文
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[8]美國的食物類胡蘿卜素含量數據[J]. 宋新娜,汪之頊.  國外醫(yī)學(衛(wèi)生學分冊). 2007(03)
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博士論文
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[2]類球紅細菌中輔酶Q10的代謝工程研究及應用[D]. 陸文強.浙江大學 2014
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[4]大腸桿菌系統改造及琥珀酸和5-氨基乙酰丙酸合成途徑的構建[D]. 康振.山東大學 2011

碩士論文
[1]危害核桃的成團泛菌及其系統進化分析[D]. 趙耘霄.山東農業(yè)大學 2016
[2]pucC超表達對Rhodobacter sphaeroides光合細菌表達體系異源蛋白表達水平的影響[D]. 程麗靜.重慶大學 2012



本文編號：3173302