普魯蘭酶作為一種淀粉脫支酶可以高效催化普魯蘭糖、支鏈淀粉等底物中α-1,6-糖苷鍵的水解,在食品加工、生物能源、制藥及化工等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用。目前,盡管有很多研究集中于挖掘新的催化性能良好的普魯蘭酶,或?qū)ΜF(xiàn)有的普魯蘭酶進(jìn)行分子改造以適應(yīng)淀粉糖化工藝的條件。但是,理想的符合工業(yè)生產(chǎn)特性的普魯蘭酶,特別是可以用于淀粉冷水解工藝的普魯蘭酶非常少。隨著淀粉水解技術(shù)的不斷革新,淀粉深加工領(lǐng)域的不斷拓展,篩選具備優(yōu)良催化性能的普魯蘭酶對于優(yōu)化生產(chǎn)工藝,降低生產(chǎn)成本,加強(qiáng)淀粉生物質(zhì)資源的開發(fā)利用具有重要意義。本研究分析了嗜溫菌Bacillus methanolicus PB1的基因組信息,找到一段候選普魯蘭酶基因（pul PB1）,在大腸桿菌中成功實(shí)現(xiàn)了該基因的異源表達(dá),并研究了相關(guān)的酶學(xué)性質(zhì)。依據(jù)生物信息學(xué)的手段對該普魯蘭酶（PulPB1）的氨基酸序列及結(jié)構(gòu)組成進(jìn)行分析,基于蛋白質(zhì)工程技術(shù)研究其N末端結(jié)構(gòu)域在酶分子催化過程中的作用,并通過定點(diǎn)突變技術(shù)對該普魯蘭酶進(jìn)行分子改造,提高了熱穩(wěn)定性。主要研究結(jié)果如下:1.將Bacillus methanolicus PB1基因組中的普魯蘭酶基因克隆至載體p... 

【文章來源】：華南理工大學(xué)廣東省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：100 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

不同來源的普魯蘭酶結(jié)構(gòu)示意圖

第一章緒論5圖1-2Ⅰ型普魯蘭酶催化多糖水解示意圖（A）支鏈淀粉；（B）普魯蘭糖Fig.1-2SchematicdiagramofthehydrolysisofpullulanandamylopectinbytypeIpullulanase1.3普魯蘭酶的性質(zhì)與應(yīng)用1.3.1普魯蘭酶的性質(zhì)研究報道的普魯蘭酶大多來源于嗜溫菌，最適溫度大部分都在50℃以上，穩(wěn)定性較差；少部分的普魯蘭酶來源于嗜熱菌，最適溫度在75℃左右，穩(wěn)定性相對較好，但酶活偏低[13]（表1-2）。普魯蘭酶的最適反應(yīng)pH的分布范圍為4.5–9.0，多數(shù)為5.0–6.5。目前，工業(yè)上在淀粉糖化時使用的多為酸性普魯蘭酶，例如，丹麥諾維信公司從嗜酸芽孢桿菌Bacillusacidopullulyticus中挖掘到的一種耐酸耐熱的普魯蘭酶，最適pH在4.5–5.0之間，最適溫度60℃[36,37]。由于其最適反應(yīng)條件與糖化酶十分接近，催化效率與穩(wěn)定性也比較好，因此被開發(fā)為商品酶應(yīng)用于淀粉糖化過程。部分研究報道的冷適應(yīng)型普魯蘭酶，最適溫度在45℃左右，在淀粉冷水解工藝（又稱生淀粉水解工藝：省去高溫蒸煮糊化等程序，直接對生淀粉進(jìn)行水解的方法）中具備一定的應(yīng)用潛力，如表1-2中所示，來源于Bacilluspseudofirmus703及Exiguobacteriumsp.SH3的普魯蘭酶Pul703與Pul-SH3，最適溫度均為45℃，且Pul703酶活達(dá)270U/mg。但是，冷適應(yīng)型普魯蘭酶的最適pH往往為中性或弱堿性，與其他糖化酶所適合的弱酸（A）（B）

第二章BacillusmethanolicusPB1普魯蘭酶在大腸桿菌中的克隆表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)研究23（16℃、20℃、25℃、30℃、37℃）和誘導(dǎo)時間（12、16、20、24、28h）對表達(dá)的重組普魯蘭酶活力的影響。其中菌液濃度測定（OD600）：使用沒有接種的LB培養(yǎng)基作為空白調(diào)零，將菌液適當(dāng)稀釋至吸光度在0.2–0.8之間，用紫外分光光度計測定其在600nm處的吸光值。細(xì)胞濕重測定（DCW，g/L）：將誘導(dǎo)表達(dá)后的發(fā)酵液50mL置于稱重后的離心管中，4℃，8000r/min離心5min棄去上清液，稱量收集到的菌體質(zhì)量，計算獲得的菌體濕重。2.3.6重組蛋白的分離純化2.3.6.1鎳柱親和層析純化誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體進(jìn)行超聲破碎得到普魯蘭酶粗酶液，用0.22μm的濾頭過濾，然后利用伯樂蛋白純化儀進(jìn)行純化。使用購于GE的5mL鎳離子親和層析柱，具體方法見操作說明書。2.3.6.2蛋白濃度及純度的測定純化得到的普魯蘭酶液采用Brad-Ford法測定蛋白濃度，首先以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2-1所示。然后測定蛋白樣品吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算其濃度。具體的操作步驟見試劑盒說明書。圖2-1牛血清蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2-1ThestandardcurveofBrad-FordmethodbasedonBSASDS-PAGE用于鑒定蛋白質(zhì)純度。具體操作如下：1．凝膠根據(jù)下表配制：

【參考文獻(xiàn)】：
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[4]重組普魯蘭酶在枯草芽孢桿菌中的高效表達(dá)[D]. 王海.華南理工大學(xué) 2018
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[6]普魯蘭酶基因挖掘、酶學(xué)性質(zhì)及結(jié)構(gòu)域進(jìn)化研究[D]. 陳思齊.華東理工大學(xué) 2016
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