乙醛酸甲酯是一種廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域的重要中間體。乙醛酸甲酯可用于合成新型的治療基因Ⅰ型的丙型肝炎感染藥物雷迪帕韋,也可用于合成泛酸的前體—D-泛解酸內(nèi)酯�；瘜W(xué)法生產(chǎn)乙醛酸甲酯需要在高溫、高壓下進(jìn)行而且容易過度氧化,生物法工藝條件溫和,環(huán)境污染小,副產(chǎn)物少,具有重要的研究價(jià)值以及廣闊的應(yīng)用前景。乙醇酸氧化酶（Glycolate oxidase,GO,EC 1.1.3.15）催化乙醇酸甲酯氧化生成乙醛酸甲酯。天然酶的性質(zhì)往往并不能滿足生產(chǎn)的需求,對特定的底物催化活力低,而高活性的乙醇酸氧化酶是酶法生產(chǎn)乙醛酸甲酯的基礎(chǔ)。本論文首先選取菠菜來源的乙醇酸氧化酶基因在大腸桿菌中重組表達(dá),并運(yùn)用蛋白質(zhì)工程手段對該乙醇酸氧化酶進(jìn)行分子改造,以提高其催化活力。其次,利用融合表達(dá)技術(shù)獲得的多功能酶來促進(jìn)可溶性表達(dá),并進(jìn)一步提升催化表現(xiàn)。將過氧化氫酶和血紅蛋白與乙醇酸氧化酶進(jìn)行融合,并對融合酶的連接肽進(jìn)行優(yōu)化,最終成功獲得表達(dá)高催化活性融合酶的重組菌。最終,以表達(dá)高催化活性融合酶的重組菌為生物催化劑,構(gòu)建酶法生產(chǎn)乙醛酸甲酯的反應(yīng)體系并對其反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。具體的內(nèi)容包括:（1）通過易錯PCR法對乙... 

【文章來源】：浙江工業(yè)大學(xué)浙江省

【文章頁數(shù)】：79 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

乙醛酸甲酯的結(jié)構(gòu)式Figure1.1Thestructureofmethylglyoxylate

跫??蟾擼?芰肯?慕洗螅?曳?應(yīng)過程中需要用到強(qiáng)氧化劑以及強(qiáng)酸，嚴(yán)重的污染環(huán)境�；瘜W(xué)法生產(chǎn)過程中還會產(chǎn)生大量副產(chǎn)物，為后續(xù)的分離純化也帶來了極大的困難。因此，尋求綠色環(huán)�？沙掷m(xù)發(fā)展的生產(chǎn)工藝是大勢所趨[8]。（1）馬來酸二甲酯臭氧氧化法TJDonohoe等將臭氧鼓泡通入含有馬來酸二甲酯的CH2Cl2溶液中2h，然后再將剩余的藍(lán)色溶液用氧氣吹掃5min。在-78℃條件下向溶液中滴加二甲基硫醚，并將反應(yīng)混合物溫?zé)嶂潦覝�。減壓除去溶劑，并將剩余的溶液通過真空蒸餾，最終得到得率為70%的無色油狀物乙醛酸甲酯，其反應(yīng)式如圖1-2所示。此法反應(yīng)速率快，污染少。缺點(diǎn)是反應(yīng)過程中需要使用過量的臭氧，給規(guī)模化的工業(yè)生產(chǎn)帶來較大的困難。圖1-2馬來酸二甲酯臭氧氧化法制乙醛酸甲酯Figure1-2Preparationofmethylglyoxylatebyozoneoxidationofdimethylmaleate（2）酒石酸二甲酯高碘酸氧化法DHorne等在冰浴冷卻的35％THF的乙醚溶液中迅速攪拌的酒石酸二甲酯溶液，加入的粉末狀的H5IO6。在0℃下攪拌1小時后，將其加熱并在25℃下攪拌直至TLC顯色表明酒石酸二甲酯完全消耗。用乙醚稀釋，過濾并用MgSO4和K2CO3干燥。最終將產(chǎn)物進(jìn)行濃縮和蒸餾，得到得率為83％的澄清無色油狀物乙醛酸甲酯，其反應(yīng)式如圖1-3所示。該法反應(yīng)條件溫和，速率快。缺點(diǎn)是通過強(qiáng)酸條件發(fā)生反應(yīng)，極易造成設(shè)備腐蝕，對反應(yīng)器有較高的要求，設(shè)備昂貴。圖1-3酒石酸二甲酯高碘酸氧化法制乙醛酸甲酯Figure1-3Preparationofmethylglyoxylatebyperiodateoxidationofdimethyltartrate（3）二甲氧基乙醛酸甲酯與乙醛酸一水化合物烷基交換法張志霞等介紹一種新型的乙醛酸甲酯合成工藝，通過二甲氧基乙醛酸甲酯與乙醛酸一水化合物的烷基化交換反應(yīng)，獲得反應(yīng)混合物。具體方法如下向250mL?

過程中需要使用過量的臭氧，給規(guī)�；墓I(yè)生產(chǎn)帶來較大的困難。圖1-2馬來酸二甲酯臭氧氧化法制乙醛酸甲酯Figure1-2Preparationofmethylglyoxylatebyozoneoxidationofdimethylmaleate（2）酒石酸二甲酯高碘酸氧化法DHorne等在冰浴冷卻的35％THF的乙醚溶液中迅速攪拌的酒石酸二甲酯溶液，加入的粉末狀的H5IO6。在0℃下攪拌1小時后，將其加熱并在25℃下攪拌直至TLC顯色表明酒石酸二甲酯完全消耗。用乙醚稀釋，過濾并用MgSO4和K2CO3干燥。最終將產(chǎn)物進(jìn)行濃縮和蒸餾，得到得率為83％的澄清無色油狀物乙醛酸甲酯，其反應(yīng)式如圖1-3所示。該法反應(yīng)條件溫和，速率快。缺點(diǎn)是通過強(qiáng)酸條件發(fā)生反應(yīng)，極易造成設(shè)備腐蝕，對反應(yīng)器有較高的要求，設(shè)備昂貴。圖1-3酒石酸二甲酯高碘酸氧化法制乙醛酸甲酯Figure1-3Preparationofmethylglyoxylatebyperiodateoxidationofdimethyltartrate（3）二甲氧基乙醛酸甲酯與乙醛酸一水化合物烷基交換法張志霞等介紹一種新型的乙醛酸甲酯合成工藝，通過二甲氧基乙醛酸甲酯與乙醛酸一水化合物的烷基化交換反應(yīng)，獲得反應(yīng)混合物。具體方法如下向250mL三口瓶中加入乙醛酸一水合物9.2g(0.1mol)，二甲氧基乙醛酸甲酯13.4g(0.1mol)，一水合對甲苯磺酸0.2g，在80℃攪拌反應(yīng)19h。在冰水浴條件下向獲得

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]融合蛋白接頭的研究進(jìn)展[J]. 毛蕓,李紅民.  功能材料. 2018(02)
[2]化學(xué)酶法合成D-泛解酸內(nèi)酯的研究進(jìn)展[J]. 汪釗,黃美娟,高亮,應(yīng)向賢,趙嫚,孫杰.  發(fā)酵科技通訊. 2016(04)
[3]雷迪帕韋及其關(guān)鍵中間體的合成研究[J]. 趙聿秋,孫光祥.  上海醫(yī)藥. 2016(09)
[4]乙醛酸酯的合成工藝研究[J]. 張志霞,朱全,劉超,王曉燕.  河北師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版). 2012(06)
[5]乙醛酸和草酸的高效液相色譜分析[J]. 劉樹彬,陸敏,張星辰,張萍,牟微.  應(yīng)用化工. 2007(10)
[6]透明顫菌血紅蛋白基因vgb和腈水解酶基因bxn在畢赤酵母中的表達(dá)研究[J]. 王清路,張銳,倪萬潮,陳毓荃,郭三堆.  生物工程學(xué)報(bào). 2004(05)
[7]菠菜乙醇酸氧化酶基因的克隆及表達(dá)[J]. 晉劍鋒,譚天偉,蘇國富.  生物工程學(xué)報(bào). 2002(02)
[8]透明顫菌血紅蛋白及其基因的研究進(jìn)展[J]. 于慧敏,沈忠耀.  微生物學(xué)報(bào). 1999(05)

博士論文
[1]雙功能β-葡聚糖酶—木聚糖酶與β-葡聚糖酶—植酸酶融合酶的優(yōu)化構(gòu)建及其酶學(xué)特性分析[D]. 陸平.浙江大學(xué) 2008



本文編號：3119861