(R)-1-（1-萘基）乙胺是合成擬鈣劑藥物鹽酸西那卡塞的關(guān)鍵手性中間體,生物合成（R）-1-（1-萘基）乙胺的方法更加綠色環(huán)保,因而受到越來越多的關(guān)注。其中,ω-轉(zhuǎn)氨酶（ω-transaminase）不對稱還原前手性酮制備手性胺具有很多優(yōu)勢。本研究發(fā)現(xiàn)節(jié)桿菌屬（Arthrobacter sp.KNK168）來源的ω-轉(zhuǎn)氨酶ArATA可以不對稱還原1-萘乙酮合成（R）-1-（1-萘基）乙胺,且具有良好的立體選擇性（99%,R）,但其催化活力較低,難以實現(xiàn)工業(yè)化應用。因此,通過分子改造提高ArATA對1-萘乙酮的催化活力,主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:采用隨機突變和半理性設計相結(jié)合的策略。一方面,通過易錯PCR構(gòu)建隨機突變文庫,同時建立適用于1-萘乙酮為底物的ω-轉(zhuǎn)氨酶高通量篩選方法,篩選到活力提升的突變體F225M、G136I、C281I和T282S;另一方面,根據(jù)晶體結(jié)構(gòu)（PDB:3WWI）進行底物對接分析,通過對底物結(jié)合口袋中16個位點進行保守性分析,發(fā)現(xiàn)V69、W156、W192、G224和A284高度保守。對剩余11個位點進行丙氨酸掃描并對G136、V199和S223點進行定點飽和突... 

【文章來源】：江南大學江蘇省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：63 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

(R)-1-(1-萘基)乙胺用于合成鹽酸西那卡塞Figure1-2(R)-(+)-1-(1-naphthyl)ethylamineusedinthesynthesisofcinacalcethydrochloride

技術(shù)路線

江南大學碩士學位論文18第三章結(jié)果與討論3.1轉(zhuǎn)氨酶庫的篩選3.1.1重組轉(zhuǎn)氨酶的構(gòu)建根據(jù)文獻報道，使用ω-轉(zhuǎn)氨酶作為生物催化劑不對稱合成手性胺是一種廣泛應用的制備方法，因此為了制備光學純(R)-1-(1-萘基)乙胺，選擇R-選擇性ω-轉(zhuǎn)氨酶作為生物催化劑是一種具有應用價值的方法。ArATA是來源于Arthrobactersp.KNK168的R-選擇性ω-轉(zhuǎn)氨酶，對(R)-1-(1-萘基)乙胺有催化活力[32]，能夠催化外消旋1-(1-萘基)乙胺生成1-萘乙酮和(S)-1-(1-萘基)乙胺，并且轉(zhuǎn)化率能達到50%，ee>99%。根據(jù)轉(zhuǎn)氨酶催化反應的逆反應，ArATA能夠催化1-萘乙酮生成(R)-1-(1-萘基)乙胺。由于基因挖掘時一般選擇相對于模板同源性在30~80%的酶序列，將ArATA在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行比對，發(fā)現(xiàn)在同源性30~80%的轉(zhuǎn)氨酶序列中，有3個酶的基因來源可在本實驗室保藏的野生菌中找到，分別是地衣形芽孢桿菌（Bacilluslicheniformis）、抑制暗棕色桿菌（Phaeobacterinhibens）和高盧根瘤菌（Rhizobiumgallicum）。因此，擬將這四種轉(zhuǎn)氨酶構(gòu)建出來，用于篩選能夠催化1-萘乙酮的轉(zhuǎn)氨酶。首先對Bacilluslicheniformis、Phaeobacterinhibens和Rhizobiumgallicum分別使用營養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基、檸檬酸鐵銨培養(yǎng)基、根瘤菌培養(yǎng)基進行活化，使用細菌基因組提取試劑盒提取基因組，并進行凝膠核酸電泳檢測，電泳分析結(jié)果如下圖3-1所示：圖3-1基因組DNA電泳圖Figure3-1AgarosegelelectrophoresisofgenomicDNA注：M：Marker；1：Rhizobiumgallicum；2：Phaeobacterinhibens；3：Bacilluslicheniformis以基因組DNA為模板，使用附錄1中P1和P2為引物對目的基因片段進行PCR擴增并進行純化回收，目的基因片段大小約為1000bp，如圖3-2所示：

【參考文獻】：
期刊論文
[1]蛋白質(zhì)工程：從定向進化到計算設計[J]. 曲戈,朱彤,蔣迎迎,吳邊,孫周通.  生物工程學報. 2019(10)
[2]ω-轉(zhuǎn)氨酶分子改造研究進展[J]. 高新星,韋平和.  生物工程學報. 2018(07)
[3]手性1-（1-萘基）乙胺的制備及其藥物應用最新進展[J]. 盧定強,夏芙潔,王琦,孫生柏,凌岫泉.  現(xiàn)代化工. 2014(05)
[4]胺基裂解酶及其在醫(yī)藥中間體生產(chǎn)中的應用[J]. 何碧波,陳小龍,鄭裕國,沈寅初.  微生物學通報. 2008(07)

碩士論文
[1]細菌耐丁醇元件的挖掘及大腸桿菌的溶劑耐受性研究[D]. 肖琳.江南大學 2019
[2]氨基酸脫氫酶的基因挖掘、定向改造及合成手性氨基酸的研究[D]. 程軍.江南大學 2017



本文編號：3102243