研究背景:水凝膠是一類具有三維網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)的聚合物,能在水中顯著溶脹但不溶解。形成水凝膠的原料包括天然材料和合成材料兩大類。天然材料具有良好的生物相容性,但存在來源有限、產(chǎn)量低及不同批次材料間有性質(zhì)差異的限制。而合成材料雖然組成和性質(zhì)可控,但往往官能團單一且生物相容性較差。通過基因工程和蛋白質(zhì)工程得到的重組蛋白質(zhì)兼具了天然材料的生物相容性和合成材料的可控性。類彈性蛋白多肽(elastin-like polypeptides,ELPs)是一類由彈性蛋白特征性功能單元串聯(lián)重復構(gòu)成的蛋白分子,通常通過基因工程方法制備。ELP與彈性蛋白類似,不僅具有良好的力學性能、生物相容性和生物可降解性,而且具備特殊的反向熱凝膠性質(zhì),因而在近些年受到廣泛關注。研究目的:設計一種ELP,建立其在大腸桿菌中的高效表達方法;以該ELP為原料,使用物理交聯(lián)、化學交聯(lián)和酶交聯(lián)方式制備水凝膠。研究方法:(1)利用重疊延伸PCR(overlap extension PCR,OE-PCR)擴增ELP核心序列,通過遞歸定向連接(recursive directional ligation,RDL)核心序列至一定重復,利用基因工程的方法構(gòu)建ELP原核表達載體pET28a-[ELP_α]_5-[ELP_β]_(12)-[ELP_α]_5。(2)使用大腸桿菌ER2566原核表達菌株,自誘導表達目的蛋白[ELP_α]_5-[ELP_β]_(12)-[ELP_α]_5。利用ELP的溫度響應型可逆相變循環(huán)(inverse transition cycling,ITC)特性進行目的蛋白的純化,并對純化后的目的蛋白進行定量。(3)分別用物理交聯(lián)、化學交聯(lián)和酶交聯(lián)的方式,探索不同濃度ELP的成膠情況。研究結(jié)果:(1)雙酶切及測序結(jié)果顯示:成功構(gòu)建pET28a-[ELP_α]_5-[ELP_β]_(12)-[ELP_α]_5原核表達載體。(2)可溶性分析表明:目的蛋白以可溶形式表達。經(jīng)純化后,目的蛋白的純度和得率分別達到92.6%和80.46%。定量結(jié)果顯示:1L誘導液可分離得到1.05g目的蛋白。(3)成膠結(jié)果顯示:ELP濃度為3%時,成膠溫度為40°C;ELP濃度為12.5%和15%時,成膠溫度為37°C。穩(wěn)定性實驗顯示:在物理交聯(lián)實驗中,3%的樣品在第21天時凝膠網(wǎng)絡完全降解;12.5%和15%的樣品在第28天時凝膠網(wǎng)絡完全降解。盡管隨著ELP濃度增加,凝膠的穩(wěn)定性有所改善,但物理交聯(lián)的水凝膠整體穩(wěn)定性依然較差;在化學交聯(lián)實驗中,3%的樣品在第21天時剩余凝膠質(zhì)量為18.67%,第28天時凝膠網(wǎng)絡仍未完全降解;12.5%和15%的樣品在第28天時剩余凝膠質(zhì)量分別為82%和91.33%�；瘜W交聯(lián)形成水凝膠的穩(wěn)定性較物理交聯(lián)大大提高;在酶交聯(lián)實驗中,3%的樣品在第21天時剩余凝膠質(zhì)量為7.67%,第28天時凝膠網(wǎng)絡基本降解;12.5%和15%的樣品在第28天時剩余凝膠質(zhì)量分別為61.67%和76.33%。酶交聯(lián)形成水凝膠的穩(wěn)定性介于物理交聯(lián)和化學交聯(lián)之間。研究結(jié)論:成功設計并合成了一種類彈性蛋白多肽,并用不同的交聯(lián)方式制備了以此多肽為基底的蛋白類水凝膠。
【學位單位】：西北大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：Q78;TQ427.26
【部分圖文】：

圖 1.1 人彈性蛋白原的 cDNA 結(jié)構(gòu)[8]。Figuer 1.1 cDNA structure of human tropoelastin.在細胞外基質(zhì)中，彈性蛋白原自組裝形成彈性蛋白，隨后與微原纖維共同組裝產(chǎn)生彈性纖維。該過程涉及彈性蛋白原之間的交聯(lián)。為了促進交聯(lián)作用的發(fā)生，彈性蛋白原必須進行排列，這種排列是通過凝聚作用產(chǎn)生的。該凝聚過程利用了彈性蛋白原的可逆相變特性。在低溫下，彈性蛋白原溶于水溶液；隨著溫度升高，彈性蛋白原分子通過疏水結(jié)構(gòu)域之間的相互作用變得有序進而發(fā)生聚集。這種現(xiàn)象完全可逆并通過熱力學控制，該過程也被稱為低臨界溶解溫度( low critical solution temperature, LCST )行為，受到蛋白質(zhì)濃度、鹽濃度和 pH 值的影響。自組裝后，彈性蛋白原分子通過親水區(qū)域的賴氨酸殘基進行酶交聯(lián)，最終形成含鎖鏈素和異鎖鏈素交聯(lián)結(jié)構(gòu)的彈性蛋白[9]。鏈間交聯(lián)和大量疏水殘基直接導致彈性蛋白不溶于水。1.1.2 彈性蛋白的性質(zhì)由于不溶于水，對彈性蛋白性質(zhì)的研究在很長一段時間內(nèi)受到了阻滯。然而，可溶

圖 1.2 遞歸定向連接示意圖Figure 1.2 Schematics of recursive directional ligation利用基因工程合成 ELP 的優(yōu)點包括：首先，從生物表達系統(tǒng)中很容易獲得產(chǎn)量相對較高的目的蛋白，且不需要色譜法，通過溫度響應性可逆相變循環(huán)可以方便地對其進行純化[13]。其次，利用該法合成 ELP 可以精確控制多肽的序列組成、分子量，從而控制其立體結(jié)構(gòu)[11, 14]，而這些變量在化學合成過程中往往難以控制[15]。再者，轉(zhuǎn)化至宿主細胞的重組質(zhì)粒可以長期保存，因此構(gòu)建好的重組質(zhì)粒可以永久使用。最后，如果目的蛋白具有高級結(jié)構(gòu)，則宿主體內(nèi)的折疊機制可以幫助形成正確的二級或三級結(jié)構(gòu)。1.2.2 類彈性蛋白多肽的性質(zhì)為了研究 ELP 聚合物的特性，Urry 和同事們根據(jù)彈性蛋白疏水結(jié)構(gòu)域中的多肽序列合成了一系列相關的寡聚體。他們首先觀察到 ELP 聚合物以類似于彈性蛋白原的方式發(fā)生凝聚。對其進行深入研究發(fā)現(xiàn)：ELP 具有熱響應性，并經(jīng)歷可逆溫度轉(zhuǎn)變( Inversetemperature transition, ITT )[16]。當溫度低于轉(zhuǎn)變溫度( Transition temperature, Tt )時，ELP

圖 1.3 ELP 的可逆溫度相變Figure 1.3 The inverse temperature transition of ELPELP 的 Tt 值可以通過分光光度計測量蛋白溶液的濁度來確定。該值由緩沖液組成、鹽濃度、聚合物濃度、多肽鏈長度、任意功能側(cè)鏈和客座氨基酸殘基的電離程度以及分子的極性排列等因素共同決定[18-21]。ELP 溫度依賴性可逆相轉(zhuǎn)變通常發(fā)生在 2-3°C 范圍內(nèi)。經(jīng)美國相關監(jiān)管機構(gòu)[22]批準，序列為(Gly-Val-Gly-Val-Pro)n的聚合物已被應用于許多組織和血液測試。對該聚合物的體內(nèi)外研究均表明其具有良好的生物相容性。這可能與 ELP 的組成和天然彈性蛋白的化學組成類似有關。此外，ELP 可生物降解，降解產(chǎn)物為天然氨基酸。由于免疫系統(tǒng)通常難以區(qū)別天然的彈性蛋白和類彈性蛋白多肽，因此ELP 還具有低免疫原性。1.2.3 類彈性蛋白多肽的應用類彈性蛋白多肽(ELP)同時具有高度的生物相容性、生物可降解性、低免疫原性和
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本文編號：2880306