堿性蛋白酶是一類具備高催化性能、環(huán)境友好的生物催化劑,其可快速有效地將蛋白類物質(zhì)分解成多肽和氨基酸,被廣泛的應(yīng)用于洗滌產(chǎn)品、皮革加工和食品加工等行業(yè)。在堿性蛋白酶的發(fā)酵過程中,可利用異源表達宿主對堿性蛋白酶進行過量表達。微生物發(fā)酵堿性蛋白酶的過程,周期短、產(chǎn)量高、營養(yǎng)物質(zhì)廉價易得,適于工業(yè)化大規(guī)模培養(yǎng)。在堿性蛋白酶的發(fā)酵生產(chǎn)和應(yīng)用研究中,大多數(shù)人只針對一種產(chǎn)堿性蛋白酶菌株,缺乏對不同菌株重組表達宿主的構(gòu)建、發(fā)酵條件、超濾純化和洗滌性能差異的了解。文章對比研究了真菌畢赤酵母和細菌枯草桿菌在重組表達宿主構(gòu)建、發(fā)酵條件、超濾純化和洗滌性能方面的差異,并進行了對比分析。第一,成功構(gòu)建了新的堿性蛋白酶異源表達宿主畢赤酵母(pPICZα-AP)和枯草桿菌(pBE2R-AP),并且兩種菌株都成功的表達了堿性蛋白酶。隨后對兩種菌株進行目標產(chǎn)物的發(fā)酵,發(fā)現(xiàn)相對于畢赤酵母,枯草桿菌表達宿主獲得的堿性蛋白酶活力更高。第二,對比研究了畢赤酵母和枯草桿菌產(chǎn)堿性蛋白酶的最優(yōu)培養(yǎng)條件。研究對比發(fā)現(xiàn),相對于枯草桿菌,畢赤酵母獲得最佳酶活力需要更長的發(fā)酵時間。在營養(yǎng)物的利用種類方面,畢赤酵母更傾向于利用甲醇、甘油和YPD;枯草桿菌則偏向于利用葡萄糖和酵母提取物,對甲醇和甘油幾乎沒有利用。在營養(yǎng)物的利用比例方面,畢赤酵母對碳源的單次需求量低于枯草桿菌,但是在碳源總添加量方面卻高于枯草桿菌。在培養(yǎng)過程的物理因素方面,兩種菌株的最佳產(chǎn)酶pH相差不大;但在培養(yǎng)溫度方面,較低的溫度更有利于畢赤酵母的產(chǎn)物表達,并且畢赤酵母在發(fā)酵過程對氧量的需求相對較大。第三,超濾作用對畢赤酵母和枯草桿菌發(fā)酵液進行了有效的濃縮,并提高了發(fā)酵液中堿性蛋白酶的活力。相對于枯草桿菌,畢赤酵母發(fā)酵液超濾過程的膜通量更低,超濾時間更長,其原因可能是畢赤酵母發(fā)酵液中溶質(zhì)粒徑較大所導致的。在畢赤酵母和枯草桿菌發(fā)酵液的超濾過程中,溶質(zhì)的粒徑和Zeta電位是動態(tài)變化的。粒徑與Zeta電位絕對值的變化趨勢相同,均隨超濾時間的延長而增大,其原因與發(fā)酵液中溶質(zhì)的聚集有關(guān)。最后,對比了在相同總酶活力下超濾前后不同菌株來源堿性蛋白酶的洗滌性能,兩種菌株發(fā)酵液超濾后的堿性蛋白酶洗滌效果會略有下降。發(fā)酵液的洗滌效果排序為:添加畢赤酵母發(fā)酵液的洗滌劑添加枯草桿菌發(fā)酵液的洗滌劑未添加堿性蛋白酶的洗滌劑;對比了在不同總酶活力下,畢赤酵母、枯草桿菌和市售堿性蛋白酶的洗滌性能,其洗滌效果排序均為:添加畢赤酵母堿性蛋白酶的洗滌劑市售堿性蛋白酶≈添加枯草桿菌堿性蛋白酶的洗滌劑,并且洗滌效果隨酶活力的升高而增加。由洗滌前后國標蛋白污布JB02的ART-FTIR光譜圖可知,畢赤酵母和枯草桿菌來源的堿性蛋白酶,在洗滌過程中均可有效的破壞蛋白污漬的肽鍵以及蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu),使蛋白質(zhì)污漬分解并從國標蛋白污布JB02脫落下來。因此,加酶洗滌劑獲得了更好的去污效果。
【學位單位】：山西大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：TQ925.2
【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
第一章 文獻綜述及選題背景
    引言
    1.1 堿性蛋白酶的性質(zhì)和催化原理
        1.1.1 堿性蛋白酶的基本性質(zhì)
        1.1.2 堿性蛋白酶底物特異性
        1.1.3 堿性蛋白酶活性
        1.1.4 堿性蛋白酶穩(wěn)定性
        1.1.5 堿性蛋白酶的催化原理
    1.2 微生物產(chǎn)堿性蛋白酶
        1.2.1 堿性蛋白酶的微生物來源
        1.2.2 細菌和真菌的細胞結(jié)構(gòu)
        1.2.3 細菌和真菌來源的堿性蛋白酶
        1.2.4 堿性蛋白酶異源表達
        1.2.5 堿性蛋白酶的微生物發(fā)酵
    1.3 堿性蛋白酶的超濾分離
        1.3.1 超濾技術(shù)原理
        1.3.2 影響生物酶超濾性能的因素
        1.3.3 提高堿性蛋白酶超濾性能的措施
    1.4 堿性蛋白酶在洗滌劑中的應(yīng)用
        1.4.1 堿性蛋白酶作為洗滌添加劑
        1.4.2 現(xiàn)代堿性蛋白酶洗滌劑的挑戰(zhàn)
        1.4.3 提高堿性蛋白酶的洗滌性能
    1.5 選題思路和研究內(nèi)容
        1.5.1 選題思路
        1.5.2 研究內(nèi)容
    1.6 本課題的創(chuàng)新之處
第二章 畢赤酵母和枯草桿菌工程菌株構(gòu)建的對比研究
    2.1 引言
    2.2 實驗材料和實驗儀器
        2.2.1 實驗所用儀器
        2.2.2 實驗所用試劑
        2.2.3 實驗所用菌株和質(zhì)粒
        2.2.4 實驗所用培養(yǎng)基
        2.2.5 實驗所用溶液
    2.3 實驗過程
        2.3.1 畢赤酵母和枯草桿菌感受態(tài)細胞的制備
        2.3.2 重組表達宿主的轉(zhuǎn)化
        2.3.3 陽性克隆的鑒定
        2.3.4 堿性蛋白酶重組菌株的篩選和表達
        2.3.5 SDS-PAGE驗證
        2.3.6 堿性蛋白酶酶活力的測定
    2.4 實驗結(jié)果和討論
        2.4.1 堿性蛋白酶產(chǎn)物酪氨酸標準曲線
        2.4.2 重組表達宿主的結(jié)果鑒定
        2.4.3 堿性蛋白酶的表達及結(jié)果分析
    2.5 本章小結(jié)
第三章 畢赤酵母和枯草桿菌最優(yōu)發(fā)酵條件的對比研究
    3.1 引言
    3.2 實驗材料和實驗儀器
        3.2.1 實驗儀器
        3.2.2 實驗試劑
    3.3 試驗方法
        3.3.1 測定不同菌株產(chǎn)堿性蛋白酶的最優(yōu)培養(yǎng)天數(shù)
        3.3.2 測定不同菌株產(chǎn)堿性蛋白酶的最優(yōu)碳源
        3.3.3 測定不同菌株產(chǎn)堿性蛋白酶的最優(yōu)氮源
        3.3.4 測定不同菌株產(chǎn)堿性蛋白酶的最優(yōu)pH
        3.3.5 測定不同菌株產(chǎn)堿性蛋白酶的最優(yōu)溫度
        3.3.6 測定不同菌株產(chǎn)堿性蛋白酶的最優(yōu)裝液量
    3.4 實驗結(jié)果和討論
        3.4.1 重組菌株的產(chǎn)酶曲線
        3.4.2 碳源對菌株產(chǎn)酶效果的影響
        3.4.3 氮源對菌株產(chǎn)酶效果的影響
        3.4.4 pH對菌株產(chǎn)酶效果的影響
        3.4.5 溫度對菌株產(chǎn)酶效果的影響
        3.4.6 裝液量對菌株產(chǎn)酶效果的影響
    3.5 本章小結(jié)
第四章 畢赤酵母和枯草桿菌超濾性能的對比研究
    4.1 引言
    4.2 實驗材料和實驗儀器
        4.2.1 實驗所用儀器
        4.2.2 實驗所用試劑
    4.3 試驗方法
        4.3.1 堿性蛋白酶發(fā)酵液的制備
        4.3.2 不同菌株堿性蛋白酶發(fā)酵液的超濾
        4.3.3 堿性蛋白酶活力的測定
        4.3.4 動態(tài)光散射測定堿性蛋白酶粒徑和電位的變化
    4.4 實驗結(jié)果和討論
        4.4.1 不同菌株發(fā)酵液超濾過程膜通量的變化
        4.4.2 不同菌株發(fā)酵液超濾過程中酶活力的變化
        4.4.3 不同菌株發(fā)酵液超濾過程中粒徑的變化
        4.4.4 不同菌株發(fā)酵液超濾過程中Zeta電位的變化
    4.5 本章小結(jié)
第五章 畢赤酵母和枯草桿菌堿性蛋白酶洗滌性能的對比研究
    5.1 引言
    5.2 實驗材料和實驗儀器
        5.2.1 實驗所用儀器
        5.2.2 實驗所用試劑
    5.3 試驗方法
        5.3.1 洗滌性能測試
        5.3.2 白度測試
        5.3.3 污布的紅外光譜測試
    5.4 實驗結(jié)果與討論
        5.4.1 超濾前后不同菌株發(fā)酵液洗滌性能的對比
        5.4.2 不同堿性蛋白酶洗滌性能的對比
        5.4.3 蛋白污布在不同堿性蛋白酶洗滌前后的ART-FTIR
    5.5 本章小結(jié)
第六章 實驗總結(jié)和展望
    6.1 實驗總結(jié)
    6.2 實驗展望
參考文獻
攻讀學位期間取得的研究成果
致謝
個人簡況及聯(lián)系方式

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