β-1,3-葡聚糖酶是降解β-1,3-葡聚糖產(chǎn)生具備藥理活性的β-葡聚糖寡糖的有效酶工具。茯苓中多糖水解成寡糖具有抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)活性,利用β-1,3-葡聚糖酶可水解茯苓中β-1,3-糖苷鍵為主鏈的可溶性或不可溶性多糖,形成寡糖進(jìn)而促進(jìn)生物活性。因此,篩選產(chǎn)β-1,3-葡聚糖酶菌株、研究β-1,3-葡聚糖酶降解茯苓多糖的應(yīng)用具有一定的意義與價(jià)值。論文基于高通量測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用,調(diào)查了土樣中微生物群落的分布及多樣性;從土樣中分離分泌葡聚糖酶的菌株并鑒定;利用分子手段獲得β-1,3-葡聚糖酶探究了其對(duì)茯苓多糖的降解;取得了以下主要結(jié)論:(1)高通量測(cè)序數(shù)據(jù)的分析結(jié)果顯示,茯苓培植土(FTL_1)中放線菌門(mén)(Actinobacteria)所占比例為18.64%,其豐度僅次于變形桿菌門(mén)(Proteobacteria),且放線菌門(mén)中鏈酶菌屬(Streptomyces)和節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)各占比為1.90%和0.78%。因此本研究確定從FTL_1篩選降解β型葡聚糖放線菌。(2)選用相應(yīng)的篩選培養(yǎng)基,從FTL_1中分離了58株放線菌,其中11株具有β-1,3-葡聚糖酶活性。首次發(fā)現(xiàn)和報(bào)道了來(lái)自北里孢菌屬(Kitasatospora)菌株SYBCQL具有β-1,3-葡聚糖酶活性。來(lái)自鏈酶菌屬的菌株SYBC17產(chǎn)酶活力最高,為1.02 U·mg~(-1)。應(yīng)用菌株SYBC17發(fā)酵了茯苓,最佳發(fā)酵時(shí)間為96 h,此時(shí)SYBC17對(duì)茯苓中多糖的降解效果最好。(3)克隆和分析了菌株SYBC17的兩個(gè)編碼β-1,3-葡聚糖酶的基因17-W和17-Q,菌株SYBCQL的基因QLK1,在分子水平驗(yàn)證了分離的菌株產(chǎn)β-1,3-葡聚糖酶。重組酶QLK1,17-W和17-Q的酶活性分別為65.82 U·mg~(-1),132.90 U·mg~(-1)和14.70 U·mg~(-1)。重組酶17-W產(chǎn)率最高。(4)生物信息學(xué)分析顯示,三個(gè)酶蛋白全為糖苷水解酶家族16,分別由一個(gè)催化結(jié)構(gòu)域及一個(gè)碳水化合物結(jié)構(gòu)域組成,其中QLK1與17-W的碳水化合物結(jié)構(gòu)域?yàn)镃MB13,而17-Q對(duì)應(yīng)結(jié)構(gòu)域?yàn)镃MB6。三個(gè)同源建模的酶蛋白與β-葡寡糖四糖成功實(shí)現(xiàn)分子對(duì)接,β-葡寡糖四糖均出現(xiàn)在催化活性中心的底物結(jié)合區(qū)。(5)酶學(xué)性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn),QLK1的最適溫度是60°C,17-W和17-Q的最適作用溫度均為55°C。QLK1和17-Q的最適pH是5.5,而17-W的最適pH是6.0,三個(gè)酶的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定良好;三個(gè)重組酶對(duì)底物的親和力由大到小的排序依次是17-W、QLK1、17-Q。(6)TLC分析重組酶對(duì)茯苓多糖的降解作用顯示,重組酶17-W降解后主要產(chǎn)生兩種類(lèi)型的寡糖,17-Q降解后主要產(chǎn)生三種類(lèi)型的寡糖。
【學(xué)位單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類(lèi)】：Q78;TQ920.1
【部分圖文】：

第一章 緒論architecture) 如圖 1-2，其中兩個(gè) β-折疊組成的片層分別各自由 6~7 條反向且平行的 β-鏈構(gòu)成兩個(gè)反向平行的 β-片層結(jié)構(gòu)十分保守，構(gòu)成 β-片層結(jié)構(gòu)的 β-折疊鏈的長(zhǎng)度和彎曲度均基本致。β-折疊形成的片層彎曲形成的空隙使酶蛋白分子在表面形成了凹面和凸面，酶蛋白分的凹面一側(cè)是具有兩個(gè)殘基為催化活性中心 (E123 和 E128) 的底物結(jié)合區(qū)，催化域結(jié)構(gòu)高保守。一部分酶蛋白的凸側(cè)中有一個(gè) Ca2+結(jié)合位點(diǎn)，均是由相距較近的 Glu14 和 Gly58 兩個(gè)距離較遠(yuǎn)的 Asp237 的羰基氧(骨架羰基氧和羰基側(cè)鏈氧)與鈣離子相互作用，起到了穩(wěn)蛋白結(jié)構(gòu)的功能如圖 1-2(A)。還有一部分酶蛋白的凸側(cè)存在一個(gè) Mg2+結(jié)合位點(diǎn)代替 Ca2+結(jié)位點(diǎn)，這個(gè)結(jié)合位點(diǎn)是由兩個(gè)相距較近的 ASP16 和 Gly66 氨基酸殘基 分別與 Asp269 的架羰基以及羧基氧，還有 Asp237 的羰基側(cè)鏈氧、水分子，共同與鎂離子相互作用。據(jù)以所述，金屬陽(yáng)離子存在于酶催化凸面，而底物卻與酶沿著空間距離比較遠(yuǎn)的凹面相互結(jié)合說(shuō)明金屬離子 Ca2+及 Mg2+對(duì)酶的催化作用無(wú)直接影響[33, 34]。此外在圖 1-2(B)的 β-1,3-葡聚酶在Cys161-Cys169和Cys181-Cys186的位置存在兩個(gè)二硫鍵也對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定作用有關(guān)但此結(jié)構(gòu)在 BglF 的結(jié)構(gòu)并沒(méi)有發(fā)現(xiàn) (圖 1-2(A))。

圖 1-1 茯苓菌核中多糖的提取Fig. 1-1 Extraction of polysaccharides from the P. cocos sclerotium多糖及其復(fù)合物(脂多糖、蛋白多糖)的防御病毒、降低血壓和血脂、多方面的藥理作用[55-58]。此外，多糖無(wú)毒副作用，安全系數(shù)高。因此中主要的多糖來(lái)源其在臨床上得以成功應(yīng)用。但是從茯苓中提取的多在生物體內(nèi)不易被消化和吸收利用，造成大規(guī)模的臨床應(yīng)用未能實(shí)現(xiàn)通過(guò)對(duì)茯苓中的多糖進(jìn)行改性來(lái)增加其溶解性、提高它的生物活性。物法、物理法、化學(xué)法三種方法為主。其中對(duì)多糖結(jié)構(gòu)進(jìn)行化學(xué)修飾其工藝流程繁瑣，無(wú)法大批量生產(chǎn)。Hamuro 等[59]根據(jù)液相、固相兩相成了水溶性的羧甲基茯苓多糖 (CMP)。生物降解則是利用外源酶與多降解的作用，該方法高效、專(zhuān)一性強(qiáng)、且無(wú)副反應(yīng)。通過(guò)酶對(duì)天然多常因分子量過(guò)大、溶解性低和黏度高等影響造成其在臨床上的應(yīng)用范揮。因此酶降解是一種多糖改性的主要手段，具有十分大的潛在應(yīng)用不溶性 β-1,3-葡聚糖發(fā)揮藥理活性，利用 β-1,3-葡聚糖酶水解作用可使和抗腫瘤性質(zhì)的寡糖，有效提高多糖的生物活性及藥用價(jià)值[60, 61]。

酶作用于茯苓中多糖的降解情況，并將降解葡聚糖重組酶與小分子寡糖的進(jìn)行對(duì)接后續(xù)重組酶產(chǎn)酶優(yōu)化及茯苓中多糖的生物活性及研究鋪墊。論文研究?jī)?nèi)容文從以下方面開(kāi)展研究：1) 利用高通量測(cè)序分析茯苓培植土及非培植土的土樣群落組成，確定在茯苓培植土 β-1,3-葡聚糖酶能力的優(yōu)勢(shì)菌群為放線菌。2) 從茯苓培植土中優(yōu)先篩選放線菌，再?gòu)姆蛛x的放線菌中篩選產(chǎn) β-1,3-葡聚糖酶菌株3) 將在放線菌中編碼 β-1,3-葡聚糖酶基因擴(kuò)增后在宿主中表達(dá)，并利用鎳柱進(jìn)行酶純純度的 β-1,3-葡聚糖酶重組酶。4) 對(duì) β-1,3-葡聚糖酶進(jìn)行同源建模并與 β-葡寡糖四糖進(jìn)行分子對(duì)接。5) 研究重組酶的酶學(xué)性質(zhì)。6) 利用分離的產(chǎn) β-1,3-葡聚糖酶菌株發(fā)酵茯苓及重組酶作用于茯苓多糖降解產(chǎn)物分析對(duì)茯苓中多糖的降解。
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本文編號(hào)：2866146