D-乳酸(D-LA)作為L-乳酸的同分異構體,是一種具有高附加值的平臺化合物。它可作為手性藥物、農藥、及其他大宗化學品的中間體,也是可降解塑料聚乳酸(PLA)的合成單體。微生物法生產D-LA可以避免化學法帶來的環(huán)境污染。釀酒酵母作為一種安全性高的單細胞低等真核生物,具有耐酸性強、易于進行基因編輯等優(yōu)點,很適合于生產D-LA。但是,外源基因在釀酒酵母中存在表達差異性,重組菌株生長變慢,酸性物質的積累對細胞毒害等問題,嚴重制約了D-LA在釀酒酵母中的生產。本文用代謝工程的方法從D-乳酸脫氫酶(D-LDH)的表達優(yōu)化,耐酸性的增強,菌株生長速率的提高等方面構建D-LA高產菌株。首先,以敲除丙酮酸脫羧酶基因的TAMH菌株為宿主菌,組合表達優(yōu)化篩選D-LA生產菌株。針對4個啟動子,5個D-LDH,以及2個終止子的組合表達研究表明,在構建的40個菌株中,含PTEF1-E.coli D-LDH-Tsynth25 表達載體的菌株TCSt,D-LA產量最高,達到5.8 g/L,光學純度達到了99.9%。為了提高D-LA的產量,將該基因表達簇插入到敲除Pdcl和Pdc6基因的YIP-01菌株的Ty1多拷貝位點,利用雙酶偶聯(lián)方法篩選高產D-LA的整合菌株�；蚪M重測序結果表明,得到的整合菌株YIP-pTCSt-301含有3個D-LDH拷貝。在分批補料條件下發(fā)酵,該菌株產生了35 g/L D-LA,得率為0.45 g/g,產率為0.9 g/L/h。為了進一步提高D-LA產量和得率,敲除了消耗D-LA的相關基因Dldl和Cyb2,轉運D-LA到胞內的相關基因Jen1,以及產乙醇的相關基因Adh1。得到的YIP-JCDA1菌株在分批補料條件下發(fā)酵,產生了80 g/L D-LA,得率提高到0.6 g/g,產率為1.1 g/L/h。其次,在YIP-JCDA1菌株的基礎上表達了Issatchenkia orientalis的IoGasl基因,其編碼蛋白具有耐受低pH和高鹽特性。得到的YIP-IJCDA1菌株在分批補料條件下發(fā)酵,D-LA達到了85.3 g/L,得率提高到0.71 g/g,產率提高到1.20 g/L/h。在此基礎上,繼續(xù)敲除甘油合成途徑的Gpd1和Gpd2基因和乙醇合成途徑的相關基因Adh5。得到的YIP-A15G12菌株,其D-LA產量達到92.0 g/L,得率為0.70 g/g,產率為1.21 g/L/h。D-LA光學純度為99.7%。再次,在YIP-IJCDA1菌株中過表達耐乙酸的Acs2基因和Haal基因,以及消耗胞質內乙醛的Ald6基因,得到的菌株的D-LA產量卻沒有顯著提高。在含IoGasl基因的YIP-IJCDA1菌株中過表達耐受乙酸的Whi2基因,菌株的葡萄糖發(fā)酵能力顯著增強。這表明Whi2基因能與IoGasl基因共同作用增強菌株在高濃度乙酸壓力下的葡萄糖發(fā)酵能力。最后,為了增加胞質乙酰輔酶A的水平,在YIP-A15G12菌株中,表達了大腸桿菌的乙酰化乙醛脫氫酶(A-ALD)基因。A-ALD基因(mhpF和eutE)的表達提高了釀酒酵母胞內的乙酰輔酶A水平,提高了菌株的生長速率。含有mhpF基因的YIP-m-ald6菌株,產D-LA的能力顯著提高。分批補料發(fā)酵55h,產率從1.21 g/L/h增加到1.68 g/L/h,D-LA產量達到了92.6 g/L,得率為0.70 g/g。D-LA光學純度達到了99.8%。
【學位單位】：中國科學院大學(中國科學院過程工程研究所)
【學位級別】：博士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：TQ921.3
【部分圖文】：

?第１章引言???第１章引言??１．１?Ｄ－乳酸的生產方法??１．１．１?Ｄ－乳酸的性質??乳酸分子式為Ｃ３Ｈ（，０３，又名２－羥基丙酸，ｅｘ－羥基丙酸，或者丙醇酸，分子??量為９０，熔點為１８．７?°Ｃ，在２５°Ｃ時密度為１．０５７?ｇ／ｍＬ。乳酸有一個手性中心，??有Ｄ－（－）乳酸（Ｄ－ＬＡ）和Ｌ－（＋）乳酸（Ｌ－ＬＡ）兩個對映異構體，其結構式如圖１．１。??乳酸溶于水、乙醇，有刺激性。乳酸的解離常數(shù)（ｐＫａ）在３．７９－３．８６之間［１］。??

?＂?—？??一－、ｗ??＾＇?ＴＡＴＡ?；＼ＡＴＧ??圖１．５啟動子結構示意圖１４２１??Ｆｉｇｕｒｅ?１．５?Ｔｈｅ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ?ｏｆ?ｐｒｏｍｏｔｅｒ１４２１．??啟動子在基因表達的轉錄調控環(huán)節(jié)起著非常重要的作用，啟動子的調控效率??會直接影響基因的表達效率。啟動子是位于結構基因５＇端上游的一段非編碼??ＤＮＡ序列。它通過活化ＲＮＡ聚合酶，使之與模板ＤＮＡ準確結合，啟動轉錄功??能。真核生物的啟動子主要由轉錄因子結合位點（ＴＦＢＳ），和非翻譯區(qū)（ＵＴＲ）??組成。轉錄因子結合位點的ＤＮＡ序列較短，它對啟動子調節(jié)功能有至關重要的??作用，這段ＤＮＡ序列稱為核心區(qū)。非翻譯區(qū)序列的長短也會影響轉錄的效果，??１２??

距離達到１０?ｂｐ就可以保障終止子的功能行使。效率元件的作用是增強下游位置??元件的效率，Ｔ富集區(qū)的作用是調控ｍＲＮＡ的穩(wěn)定性和ｍＲＮＡ的半衰期［４９］。這??種終止子的結構示意圖如圖１．６所示。??３?—〇嚴??Ｔ，，，詹???５?－?ＴＡＧ?ＴＡＴＡＴＡ?ＡＡＷＡＡＡ?Ｔｒｋｈ?Ｙ（Ａ）？?Ｔｒｉｃｈ?－?３，??ＥＨＩｃｉｅｎｃｙ?Ｐｏｓｉｔｉｏｎｉｎｇ?Ｐｏｌｙ?Ａ）??ｂ?令，?Ｔ＿〇ｒ??５—?ＴＡＧ?ＴＡＴＡＴＡ?ＡＣＴＧＴＣＴＡＧＡ?ＡＡＴＡＡＡ?ＧＡＧＴＡＴＣＡＴＣ?ＴＴＴＣＡＡＡ?－?－ｖ??Ｃ??Ｔｅｍｙｎａｔｏｒ?＾??５－ｉ?ＴＡＧ?｜｜?＊?（ＴＡ）ｎ?＊?ＡＡＷＡＡＡ?＊?Ｙ（Ａ）ｎ?＊?＿?ｒ??Ｕｐｓｔｒｅａｍ?Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ?Ｌｉｎｋｌ?Ｐｏｓｉｔｉｏｎｉｎｇ?Ｌｉｎｋ２?Ｐｏｌｙ（Ａ）?Ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ??圖１．６終止子結構示意圖１４９１??Ｆｉｇｕｒｅ?１．６?Ｔｈｅ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ?ｏｆ?ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ１４９１，?（ａ）?Ｇｅｎｅｒａｌ?ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?ａ?ｙｅａｓｔ?ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ，?（ｂ）??Ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ?ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ?ｂｙ?ａｄｄｉｎｇ?Ｌｉｎｋ?ｅｌｅｍｅｎｔｓ，?（ｃ）?Ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ??ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ?ｂｙ?ａｄｄｉｎｇ?Ｌｉｎｋ?１，?Ｌｉｎｋ２，?Ｕｐｓｔｒｅａｍ，?ａｎｄ?Ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ?ｅｌｅｍｅｎｔｓ．??常見的酵母天然終止子有Ｔｃｔｃ／
【參考文獻】

相關期刊論文 前2條

1 陳國強;王穎;;中國“生物基材料”研究和產業(yè)化進展[J];生物工程學報;2015年06期

2 甄光明;;乳酸及聚乳酸的工業(yè)發(fā)展及市場前景[J];生物產業(yè)技術;2015年01期

本文編號：2865261