發(fā)布時間：2020-08-17 21:55

【摘要】：細胞膜表面的糖作為細胞的最外層,是一類被細胞外環(huán)境最先識別的分子,因此細胞膜表面糖類參與了眾多重要的生物過程,比如細胞分化、免疫反應、疾病進展及細胞的凋亡等。然而天然糖類結(jié)構(gòu)的多變、異質(zhì)和復雜性,限制了研究者們探索糖分子的結(jié)構(gòu)和種類對特定細胞功能的影響,因此通過化學合成的手段制備結(jié)構(gòu)規(guī)整可控的糖聚物并結(jié)合細胞膜表面改性方案將其修飾到細胞膜表面,有助于研究具有特定結(jié)構(gòu)的糖聚物對細胞間的信號交流以及細胞功能的影響,為細胞膜表面工程的發(fā)展提供方法論指導及應用基礎。基于以上思路,本論文圍繞“合成糖聚物對細胞膜的改性及對細胞功能的調(diào)控研究”這一主題展開了系列研究工作。鑒于細胞膜表面糖類在調(diào)控胚胎干細胞(ESCs)分化行為和免疫反應這兩個過程中的重要性,本論文利用合成糖聚物修飾到細胞膜表面實現(xiàn)對上述兩種過程中細胞功能的調(diào)控。首先通過可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移(RAFT)聚合與聚合后修飾(PPM)相結(jié)合,制備了新型的磷脂化糖胺聚糖類似物,系統(tǒng)研究了其對不同種類細胞膜表面的修飾,以及對小鼠ESCs(mESCs)神經(jīng)分化行為的影響和對特定信號通路的調(diào)控作用,為細胞膜表面糖類和受體參與的ESCs其他分化行為的研究提供了新的途徑和思路。鑒于磷脂化糖聚物在細胞膜表面的停留半衰期通常為幾個小時,在后續(xù)的研究中我們進一步發(fā)展了一種基于膜結(jié)合HaloTag蛋白(HTP)平臺在細胞膜表面穩(wěn)定修飾外源糖聚物的方案,擬研究發(fā)生在較長時間尺度上的生物過程,例如免疫調(diào)控過程。我們結(jié)合了重組蛋白技術與RAFT聚合方法在細胞膜表面穩(wěn)定修飾系列特定結(jié)構(gòu)糖聚物,研究了不同種類的合成糖聚物修飾癌細胞后對巨噬細胞極化及樹突狀細胞成熟的影響,突出了癌細胞膜表面特定結(jié)構(gòu)糖聚物在調(diào)控免疫細胞活性過程中的重要性,有望實現(xiàn)糖聚物改性的癌細胞在腫瘤免疫治療中的應用。主要研究內(nèi)容如下:(一)新型磷脂化糖胺聚糖類似物的合成及其對細胞膜表面的修飾。首先采用RAFT聚合方法,將4-乙烯基苯磺酸鈉(SS)、N-甲基丙烯酰葡糖胺(MAG)和甲基丙烯酰氧基熒光素(FluMA)進行聚合,制備了一系列綠色熒光素標記的糖胺聚糖類似物(pSMF),進一步將聚合物末端還原成巰基后與合成的馬來酰亞胺化的磷脂分子(MAL-DPPE)發(fā)生點擊反應,從而將磷脂分子接枝到糖胺聚糖類似物主鏈上。通過核磁氫譜、紅外以及聚合物溶液巰基密度的測定驗證了磷脂化糖胺聚糖類似物(DPPE-pSMF)的成功合成。激光共聚焦顯微鏡熒光照片及單個細胞綠色熒光強度分布證明了 DPPE-pSMF成功結(jié)合到模型細胞HeLa的表面,而不帶磷脂基團的pSMF則被HeLa細胞內(nèi)吞;流式細胞儀結(jié)果證明了 DPPE-pSMF 結(jié)合到 HeLa 細胞膜表面的量有一定的聚合物濃度依賴性;并且結(jié)合到細胞膜表面的糖胺聚糖類似物具有促進L929細胞增殖的效果。(二)磷脂化糖胺聚糖類似物對mESCs細胞膜表面的修飾及其對mESCs神經(jīng)分化的影響。倒置熒光顯微鏡圖片證明了 DPPE-pSMF孵育mESCs細胞1小時后能成功修飾到mESCs表面上。用不同糖聚物誘導神經(jīng)分化14天后的結(jié)果顯示:DPPE-pSMF孵育細胞的β3-tubulin(神經(jīng)元特異性表達marker)表達量分別達到pSMF和天然肝素孵育的細胞表達量的～1.9倍和～3.8倍,并且在相同的分化周期下,與pSMF和天然肝素孵育的細胞相比,DPPE-pSMF孵育的細胞分化的神經(jīng)細胞更多。我們進一步探索了 DPPE-pSMF促進mESCs高效分化成神經(jīng)細胞的機制,結(jié)果顯示修飾到mESCs細胞膜表面的合成糖胺聚糖類似物可以增強成纖維生長因子2(FGF2)與細胞膜表面的結(jié)合,并增強了細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(ERK1/2)的磷酸化,表明DPPE-pSMF修飾mESCs膜后增強了對FGF2-ERK1/2信號通路的激活。上述結(jié)果揭示了我們合成的特定結(jié)構(gòu)糖胺聚糖類似物引入到mESCs能夠促進其神經(jīng)分化的高效性,且該細胞膜表面修飾糖聚物的方案也可以用于調(diào)控細胞膜表面受體介導的其他細胞功能。(三)基于HTP的蛋白融合技術與RAFT聚合相結(jié)合在細胞膜表面穩(wěn)定修飾合成糖聚物。首先通過基因轉(zhuǎn)染將合成的HTP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進HeLa細胞,篩選21天后得到細胞膜表面穩(wěn)定表達HTP的HeLa細胞系(HTP-HeLa);進一步通過化學合成的手段制備了一種新型的氯代烷烴修飾的鏈轉(zhuǎn)移劑(CPADB-C1),利用該合成的鏈轉(zhuǎn)移劑進行了 MAG和生物素單體的RAFT聚合,得到氯代烷烴修飾的生物素標記的葡萄糖聚合物pMB。通過核磁及體積排除色譜(SEC)驗證了pMB的成功制備。激光共聚焦熒光圖片結(jié)果證明了 pMB于37oC下孵育HTP-HeLa 1 h可以成功修飾到細胞膜表面,并且其在細胞膜表面的停留時間長達7天,證明通過細胞膜表面結(jié)合的HTP在細胞膜表面引入外源糖聚物方案的穩(wěn)定性。(四)不同結(jié)構(gòu)合成糖聚物修飾的癌細胞對巨噬細胞極化及樹突狀細胞成熟的影響。循環(huán)腫瘤細胞在體內(nèi)可以“自我歸巢”到初生腫瘤或轉(zhuǎn)移性腫瘤部位的特性表明腫瘤細胞可以作為攜帶治療性試劑的載體�；诖�,我們提出利用糖聚物改性的癌細胞來原位刺激腫瘤部位的免疫細胞,從而誘導抗癌活性的概念。首先驗證了合成糖聚物修飾的癌細胞在體外刺激巨噬細胞極化和樹突狀細胞成熟的效果。以合成的CPADB-C1為鏈轉(zhuǎn)移劑,分別進行了 MAG和N-甲基丙烯酰甘露糖胺(MAM)的RAFT聚合,得到氯代烷烴修飾的兩種結(jié)構(gòu)規(guī)整的糖聚物pMAG和pMAM,核磁和SEC驗證了 pMAG和pMAM的成功制備。將合成的兩種糖聚物修飾到HTP-HeLa表面分別得到pMAG-HeLa和pMAM-HeLa,結(jié)果表明pMAG-HeLa和pMAM-HeLa都具有促進U937向M1型極化的效果,糖聚物改性的癌細胞顯著提高了 M1型巨噬細胞表面抗原CD86的表達,并且上調(diào)了促炎因子 IL-12p70、TNF-α和iNOS分泌水平;同時糖聚物改性的癌細胞還具有促進樹突狀細胞成熟的效果,且其在小鼠體內(nèi)皮下注射時幾乎沒有致瘤性。這些結(jié)果展現(xiàn)了糖聚物改性的癌細胞在癌癥免疫治療中的應用前景。
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R730.51;TQ317
【圖文】：

的分子機制。下面我們對這方面工作的研究進展進行詳細介紹。逡逑（ａ）邐Ｊ＂邐Ｗ＞0ｍ邋Ｆｕｃｏｍ逡逑！邋Ｓｉａｌｉｃ邋ａｃｉｄ邐！逡逑：３0Ｈ邋ＣＯｊ．邐「ｌ邋ＮＨＡｃ邋．］逡逑巧ｎ％丨－逡逑ｉ堒ｇ踅逡逑（ｂ）邐ＣＭｉｎｋｏｄ邋ｇｌｙｃａｎ邐ｒ0Ｈ邐《ｃａ，Ｈ？逡逑Ｑｌｕｃｕｒｏｎｔｃ邋Ａｃｔｄ邐0邐0＊邋＿邋Ｉ逡逑ＧＰ，邋ａｎｃｈｏｒ逡逑Ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ邐（ｅ）逡逑＜Ｃ＞邐~�。驻。＾在：：辶x希恚镥澹危歟椋睿耄澹溴澹紓歟悖幔鑠義賢跡保蠶赴け礱嫖逯痔歉春銜锏慕峁梗媯保常蒎義希疲椋紓澹保插澹櫻簦潁酰悖簦酰潁澹簀澹錚駑澹簦瑁邋澹媯椋觶邋澹簦穡澹簀澹錚駑澹紓歟悖錚悖錚睿輳酰紓幔簦澹簀澹錚鑠澹悖澹歟戾澹恚澹恚猓潁幔睿澹簀義希插義

本文編號：2795883