【摘要】：表面活性素(surfactin)是來自于微生物的脂肽類次級代謝產(chǎn)物,具有優(yōu)良的表面活性和乳化性,是一種良好的生物表面活性劑。此外表面活性素一般還具有抗菌、抗病毒和抗癌等生物活性,因此在食品工業(yè)、醫(yī)藥行業(yè)和環(huán)境修復(fù)等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用價值。但是天然菌株產(chǎn)生表面活性素的能力通常很低,限制了其在生產(chǎn)中的應(yīng)用,因此通過誘變菌株提高表面活性素的產(chǎn)量有著十分重大的意義。本研究首先利用常壓室溫等離子體(Atmospheric and Room Temperature Plasma,ARTP)誘變枯草芽孢桿菌,篩選高產(chǎn)表面活性素的突變株,并采用基因組學(xué)等方法初步研究其誘變機制;其次,對突變株的發(fā)酵工藝分別進(jìn)行單因素和響應(yīng)面優(yōu)化試驗,獲得最優(yōu)發(fā)酵工藝條件;對最優(yōu)發(fā)酵工藝條件下突變株發(fā)酵產(chǎn)生的表面活性素進(jìn)行提取,鑒定其結(jié)構(gòu),并研究其功能特性。本文的主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下:(1)ARTP誘變選育高產(chǎn)表面活性素菌株的研究。根據(jù)表面活性素產(chǎn)量從6株芽孢桿菌中通過對比選擇枯草芽孢桿菌CICC 10721為出發(fā)菌株,其表面活性素產(chǎn)量為0.73 mg/mL,利用ARTP對其進(jìn)行誘變育種,結(jié)果表明在誘變時間24 s、功率100 W、載氣量10 SLM(標(biāo)況下升每分鐘,Standard Litre per Minute)的條件下,ARTP對菌株致死率為92.21%。在該條件下以溶血圈初篩、搖瓶發(fā)酵復(fù)篩的方法篩選獲得突變菌株M45,其溶血圈直徑與菌落直徑比值達(dá)到6.11,表面活性素產(chǎn)量相對出發(fā)菌株提高了35.6%,達(dá)到0.99mg/L且傳代穩(wěn)定。通過對比出發(fā)菌株和突變菌株的發(fā)酵動力學(xué)參數(shù),發(fā)現(xiàn)突變菌株M45的最大菌體干重、最大生長速率以及產(chǎn)物表面活性素合成參數(shù)等均大于出發(fā)菌,說明突變菌株M45的生長性能和發(fā)酵產(chǎn)表面活性素性能均高于出發(fā)菌株。(2)對ARTP誘變枯草芽孢桿菌CICC 10721的機制進(jìn)行初步研究。首先,通過掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)ARTP誘變處理后的菌體形態(tài)發(fā)生改變,出現(xiàn)彎曲、突出、凹陷、變長以及破損等現(xiàn)象,另外,誘變后的菌體胞內(nèi)鈣離子濃度顯著增加,說明ARTP處理改變了枯草芽孢桿菌細(xì)胞膜的通透性。通過基因組重測序分析,發(fā)現(xiàn)突變株M45相對于出發(fā)菌株發(fā)生了66個SNP非同義突變位點,涉及到30個基因,將差異基因編碼的氨基酸序列分別在GO(Gene Ontology)、KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)、eggNOG(evolutionary genealogy of genes:Non-supervised Orthologous Groups)數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對,發(fā)現(xiàn)差異基因中dltC、ytrC和ycbP等與膜組成相關(guān),OTC、argF和argI基因與氨基酸轉(zhuǎn)運和代謝相關(guān),argF、yobL和pbpA基因與有機酸的結(jié)合與代謝有關(guān),fevC、ytrC、secDF和agG基因涉及到細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運。(3)以表面活性素產(chǎn)量為主要評價指標(biāo),對突變菌株M45進(jìn)行了發(fā)酵工藝的優(yōu)化。單因素試驗結(jié)果表明,影響表面活性素產(chǎn)量的主要因素是初始pH值、接種量和葡萄糖含量,通過響應(yīng)面優(yōu)化試驗后得到最優(yōu)發(fā)酵工藝條件為:葡萄糖含量4.35%(W/V)、硝酸銨含量0.8%(W/V)、接種量4.68%(V/V)、初始pH值7.14、發(fā)酵溫度30℃、搖床轉(zhuǎn)速180 r/min,在此條件下,表面活性素產(chǎn)量為2.15 mg/mL,相比優(yōu)化前提高了148%。(4)對突變菌株M45產(chǎn)生的表面活性素進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定和功能特性的研究。高效液相色譜分析發(fā)現(xiàn)從發(fā)酵液提取的表面活性素純度達(dá)到89.3%,通過氨基酸組成分析和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析等發(fā)現(xiàn)其中主要的表面活性素類型有:C_(12)2 surfactin、C_(13)3 surfactin、C_(14)4 surfactin、C_(15)5 surfactin和C_(16)6 surfactin。對表面活性素提取物的表面活性、乳化性、抗氧化性等研究發(fā)現(xiàn):表面活性素提取物的臨界膠束濃度約為0.1 mg/mL,該濃度下溶液表面張力比對照組降低56%;5mg/mL的表面活性素提取物溶液乳化指數(shù)即可達(dá)75%,且在5 d后僅下降2.7%;提取物對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基清除的IC_(50)濃度為4.42 mg/mL。研究表面活性素提取物對結(jié)腸癌細(xì)胞(Caco-2)、肝癌細(xì)胞(HepG2)和宮頸癌細(xì)胞(Hela)增殖的抑制效應(yīng),發(fā)現(xiàn)表面活性素提取物對三種癌細(xì)胞增殖均具有顯著的抑制作用,其作用24 h后抑制增殖的IC_(50)濃度分別為293.11、90.94和81.67μg/mL。
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：TQ423;TQ920.6
【圖文】：

其中表面活性素是發(fā)現(xiàn)最早且生物表面活性最域具有廣泛的應(yīng)用價值而備受關(guān)注[5,6]。從枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)液中首次發(fā)現(xiàn)表面活性素，由七肽上第 7 個氨基酸殘基通過內(nèi)酯鍵與 12接而成，其結(jié)構(gòu)如圖 1.1 所示[8]。表面活性素的6 和 7 位；而親水性谷氨酸和天冬氨酸位于第 1。表面活性素的同分異構(gòu)體在相同位置上的氨，其異構(gòu)體 A/B/C 的第七位氨基酸分別為亮氨其獨特的結(jié)構(gòu)，表面活性素是一種非常強大的力從 72 mN/m 降低至 27 mN/m，同時具有較好面活性素還具有抗菌活性，但沒有明顯的殺菌性素具有抗病毒、抗腫瘤、抗凝血和抑制酶等活

M43 M80 M101 M116 M156 M1730.00.20.40.60.8面活性素產(chǎn)量（表gmmL/菌株編號對照圖 2.6 復(fù)篩菌株中的表面活性素產(chǎn)量Fig. 2.6 surfactin yield of secondary screening strains產(chǎn)表面活性素傳代穩(wěn)定性結(jié)果.7 中復(fù)篩出的 M36、M38、M45、M56、M77、M79和 M量提高較明顯的菌株進(jìn)行產(chǎn)表面活性素傳代穩(wěn)定性試驗穩(wěn)定性有一定的差異，結(jié)果如圖 2.7所示。

江蘇大學(xué)碩士學(xué)位論文示，其中 A1、A2 為對照組，B1、B2 為 ARTP 處理組，可以看出對照組菌體形狀規(guī)則，細(xì)胞膜無破損現(xiàn)象，正處于分裂過程。ARTP 處理后的菌體發(fā)生以下幾種變化：一些細(xì)胞形狀發(fā)生不同程度的彎曲、突出、凹陷和變長，一些細(xì)胞有破裂的情況，說明 ARTP 發(fā)射的等離子流對枯草芽孢桿菌 CICC 10721的細(xì)胞膜有一定的刺激作用，導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)的改變，一些不耐受菌會直接破裂死亡，而一些抗性較強的菌則會發(fā)生不同的改變并存活下來，其生長增殖可能因而受到促進(jìn)。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2759290