【摘要】：1,3-丙二醇(1,3-propanediol,1,3-PD)是一種重要的化學(xué)品,在食品、藥品、化工等領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用。微生物合成法是一種成本低廉、環(huán)境友好的新型合成方法,但天然的1,3-PD生產(chǎn)菌株都面臨產(chǎn)物耐受性低、副產(chǎn)物對原菌的毒性等問題。Clostridium butyricum作為其中一種生產(chǎn)菌株,具有菌種為益生菌和不需要昂貴輔酶添加的優(yōu)勢。本研究針對C.butyricum轉(zhuǎn)化甘油生產(chǎn)1,3-PD中的產(chǎn)物低耐受性問題,對原始菌株進(jìn)行了NTG和ARTP相結(jié)合的物理化學(xué)復(fù)合誘變的方法,獲得了一株1,3-PD高耐受菌株;隨后,利用C.butyricum高耐受菌株發(fā)酵生產(chǎn)1,3-PD,優(yōu)化了甘油轉(zhuǎn)化1,3-PD的條件。最后,對原始株和突變株進(jìn)行多組學(xué)的分析,挖掘與1,3-PD耐受性相關(guān)的基因與蛋白,初步驗證部分蛋白質(zhì)的功能。主要的研究結(jié)果如下:(1)采用一系列1,3-PD濃度確定了原始菌株C.butyricum XYB11的初始耐受性,隨后利用NTG和ARTP的物理化學(xué)復(fù)合誘變,得到了突變株C.butyricum YP855,其1,3-PD耐受性相比原始出發(fā)菌株提高了30.8%。(2)采用單因素法和響應(yīng)面法對突變株C.butyricum YP855進(jìn)行1,3-PD分批發(fā)酵條件的優(yōu)化,得到1,3-PD分批發(fā)酵的最佳條件為:甘油濃度81.0 g/L,酵母提取物濃度1.6 g/L,發(fā)酵時間為21.7 h,發(fā)酵溫度為36.7℃。在最佳條件下進(jìn)行1,3-PD的分批發(fā)酵,得到1,3-PD的最終產(chǎn)量為37.20 g/L,產(chǎn)率為0.51 g/g,生產(chǎn)強度為1.71 g/(L·h),比原始菌株分別提高了29.48%、18%和29%。(3)對C.butyricum XYB11進(jìn)行了全基因組的測序,預(yù)測并注釋了基因結(jié)構(gòu)與功能;將C.butyricum XYB11原始株和突變株進(jìn)行組學(xué)分析,結(jié)合全基因組測序結(jié)果,由轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)獲得了差異表達(dá)的基因,由蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)得到了差異表達(dá)的蛋白,通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)的聯(lián)合分析,開展了差異基因和差異蛋白的GO類別、KEGG代謝通路等富集分析與比較,并從功能的角度分析關(guān)鍵基因和蛋白與C.butyricum的1,3-PD耐受性關(guān)系,初步篩選得到7個可能與C.butyricum的1,3-PD耐受性相關(guān)的關(guān)鍵基因,從而用于后續(xù)基因功能的初步驗證。(4)從C.butyricum XYB11中克隆得到上述的7個關(guān)鍵基因,利用無縫克隆技術(shù)成功構(gòu)建了7個重組質(zhì)粒pET-gene,轉(zhuǎn)化各個重組質(zhì)粒,在E.coli中成功表達(dá)了這些蛋白,對各個重組菌1,3-PD的耐受性進(jìn)行了檢測,初步驗證了這些關(guān)鍵蛋白的功能,得知組氨酸激酶、ABC轉(zhuǎn)運器、異檸檬酸脫氫酶和甲基接受化學(xué)趨向性蛋白可能與C.butyricum的1,3-PD耐受性相關(guān)。結(jié)合多組學(xué)結(jié)果,分析了篩選出的關(guān)鍵蛋白與耐受性相關(guān)的可能分子機制。
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：TQ923
【圖文】：

3-PD 的作為溶劑用途也較廣泛，可以作水基油墨，例如噴墨和絲網(wǎng)油墨，用作食品標(biāo)記油墨，具有較好的穩(wěn)定性，打印特性優(yōu)良[15]。（5）1,3-PD 是有機合成的重要中間體，可用于各種類型的藥物，如維生素H 和免疫類等藥物的合成，也可作為香料；同時，作為化妝品中的添加物，可作為潤膚劑與保濕劑。因此，開發(fā)經(jīng)濟高效的 1,3-PD 的生產(chǎn)方式對于各項工業(yè)發(fā)展都有重要的意義[16]。目前，合成 1,3-PD 的常規(guī)方法是通過丙烯醛的水合，以及環(huán)氧乙烷的加氫甲酰化[17]，這些化學(xué)合成方法無論從經(jīng)濟角度還是生態(tài)角度來看，都具有成本高和環(huán)境不友好等的缺點。由 DuPont 公司開發(fā)的甘油到 1,3-PD 的酶促轉(zhuǎn)化開創(chuàng)了 1,3-PD 合成的新紀(jì)元，迄今為止，許多企業(yè)和科研機構(gòu)已經(jīng)開發(fā)了許多方法來從粗制或純甘油中生產(chǎn) 1,3-PD，通過優(yōu)化天然菌株或開發(fā)基因工程菌株的方法，可有效提高生物法生產(chǎn) 1,3-PD 的產(chǎn)量，其結(jié)構(gòu)簡式和反應(yīng)簡式如圖 1.1 所示。

圖 1.2 甘油的代謝通路圖[28]Fig 1.2 Metabolic pathways of glycerol catabolism源宿主的基因工程菌轉(zhuǎn)化代謝工程技術(shù)的發(fā)展，開發(fā)了許多新的工程菌來實現(xiàn) 1,3-PD，大腸桿菌（Escherichia coli）作為最常用的蛋白表達(dá)異源宿 1,3-PD 異源宿主生產(chǎn)研究最透徹的系統(tǒng)。將 E. coli 用于 1,3杜邦和 Genencor 公司合作開發(fā)的[30]，底物為葡萄糖，主要通，將釀酒酵母來源的可轉(zhuǎn)化葡萄糖為甘油的基因和 K. pneum基因克隆到E. coli K12中，同時利用E. coli自有的1,3-PDDH編碼），實現(xiàn)了 1,3-PD 的高效合成，產(chǎn)量達(dá)到 130 g/L，實現(xiàn)ng 等[31]采用相似的方法，為了改善 1,3-PD 的工業(yè)生產(chǎn)，在設(shè)計了由 clts857 阻遏物調(diào)節(jié)的溫度敏感性 λ 噬菌體 PL和 P

將這些標(biāo)準(zhǔn)樣品放入液相色譜儀進(jìn)樣系統(tǒng)中，分別得到峰面積，運用（Version 2018，OriginLab，US），以濃度為橫軸，以峰面積為縱軸，與峰面積的散點圖，并將散點圖進(jìn)行線性擬合，得到擬合曲線，即為各標(biāo)準(zhǔn)曲線。再用母液配制一個一定濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)樣品，在色譜儀中進(jìn)以驗證確保四種物質(zhì)可以在色譜柱中得到很好的分離效果。結(jié)果與討論 標(biāo)準(zhǔn)樣品的液相結(jié)果及標(biāo)準(zhǔn)曲線將配制好的混標(biāo)進(jìn)樣檢測，得到的吸收峰如圖 3.1 所示，由圖可知，四在上述色譜條件下得到了較好的分離。結(jié)合各化合物濃度大小和單標(biāo)樣可知，四種待測化合物在該條件下的保留時間（Rt）依次為：甘油，4.61，5.06 min；1,3-PD，5.92 min；丁酸，6.56 min。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2758377