【摘要】：糖苷是一類(lèi)重要的次級(jí)代謝天然產(chǎn)物,具有多種藥理活性,在醫(yī)藥、食品、保健品領(lǐng)域都有廣泛應(yīng)用。糖苷的生物合成需要兩種前體,由于苷元和活性糖供給的限制,單菌合成糖苷的效率往往很低。本文以紅景天苷和淫羊藿次苷D2為例,采用匯聚線(xiàn)路,由苯丙氨酸缺陷的BMT菌株合成酪醇,酪氨酸缺陷的BMS菌株合成UDP-葡萄糖和糖苷,組成大腸桿菌共培養(yǎng)系統(tǒng),研究了途徑構(gòu)建和共培養(yǎng)系統(tǒng)的優(yōu)化控制。我們構(gòu)建酮基脫羧酶基因kdc4的組成型表達(dá)載體,得到菌株BMT21,搖瓶發(fā)酵36h,可生產(chǎn)酪醇1.46g/L。在UDP-葡萄糖強(qiáng)化菌株BMS9中,表達(dá)擬南芥來(lái)源的密碼優(yōu)化的糖基轉(zhuǎn)移酶基因synugt85a1,得到菌株BMS23,搖瓶發(fā)酵36h,可將500mg/L酪醇幾乎全部轉(zhuǎn)化,生成927.04mg/L紅景天苷。BMT21與BMS23共培養(yǎng)后,無(wú)需添加苯丙氨酸和酪氨酸,在極限培養(yǎng)基上能形成穩(wěn)定良好的互養(yǎng)生長(zhǎng)關(guān)系。為了解除共培養(yǎng)系統(tǒng)中兩個(gè)菌株對(duì)碳源的競(jìng)爭(zhēng),在敲除ptsG基因的基礎(chǔ)上,敲除manZ基因,構(gòu)建了優(yōu)先利用木糖的菌株BMT23;敲除xylA基因,構(gòu)建了只能利用葡萄糖的菌株BMS24。研究了葡萄糖木糖比例、接種比例對(duì)共培養(yǎng)系統(tǒng)和糖苷合成的影響,優(yōu)化了發(fā)酵控制。在最適條件下,共培養(yǎng)系統(tǒng)搖瓶發(fā)酵36h可合成紅景天苷670.58mg/L,只有少量酪醇積累。在5L發(fā)酵罐中補(bǔ)料發(fā)酵129h,紅景天苷產(chǎn)量達(dá)6.03g/L,沒(méi)有中間產(chǎn)物積累。為了驗(yàn)證共培養(yǎng)系統(tǒng)的靈活性,選用非特異性的糖基轉(zhuǎn)移酶YjiC,同時(shí)生產(chǎn)紅景天苷和淫羊藿次苷D2。經(jīng)過(guò)對(duì)碳源、接種比例等發(fā)酵條件優(yōu)化,在最適條件下?lián)u瓶發(fā)酵48h,可生產(chǎn)403.45mg/L紅景天苷,409.34mg/L淫羊藿次苷D2。在5L發(fā)酵罐中補(bǔ)料發(fā)酵84h,紅景天苷產(chǎn)量為2.27g/L,淫羊藿次苷D2產(chǎn)量分為2.38g/L。將苷元和活性糖由兩種菌株分別合成,組成共培養(yǎng)系統(tǒng),是一種非常有潛力的生產(chǎn)糖苷策略,而且對(duì)其他復(fù)雜天然產(chǎn)物的高效合成也有借鑒價(jià)值。
【學(xué)位授予單位】：天津大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：TQ929
【圖文】：

圖 1-1 紅景天苷化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1-1 Chemical Structure of Salidroside理活性藥理活性，主要體現(xiàn)在以下五個(gè)方面。。近年來(lái)，關(guān)于紅景天苷保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)證明紅景天苷可以通過(guò)抑制線(xiàn)粒體代謝 核糖體蛋白 S6 激酶[3]磷脂酰肌醇-3 激酶a2+超載，下調(diào)半胱天冬酶-3[5]的表達(dá)等機(jī)和皮質(zhì)神經(jīng)元由于損傷因子及氧化因子療仍然是恢復(fù)神經(jīng)損傷主要手段，相關(guān)療神經(jīng)腦缺血性和神經(jīng)變性疾病的新藥年來(lái)，動(dòng)物模型試驗(yàn)證實(shí)了紅景天苷可

圖 1-2 酪醇合成途徑Fig. 1-2 Tyrosol biosynthetic pathways酪氨酸脫羧途徑合成酪醇需經(jīng)過(guò)三步，首先在酪氨酸脫羧酶（tyrosinedecarboxylase，TyrDC）催化下合成酪胺，再經(jīng)單氨氧化酶（tyramine oxidase，TYO）催化合成 4-羥基苯乙醛（4-hydroxyphenylacetaldehyde，4HPAA），最后由對(duì)羥基乙醇脫氫酶（ethanol dehydrogenase, ADH）還原合成酪醇。Keasling 課題組[19]于 2012 年利用罌粟（Papaver somniferum）來(lái)源的酪氨酸脫羧酶 TyrDC和來(lái)自藤黃微球菌（Micrococcus luteus）的酪氨酸單氧化酶 TYO，以及大腸桿菌內(nèi)源的乙醇脫氫酶構(gòu)建酪醇生物合成途徑，在大腸桿菌中首次實(shí)現(xiàn)了酪醇的從頭合成。酪氨酸轉(zhuǎn)氨代謝途徑合成酪醇需要經(jīng)過(guò)三步，酪氨酸在酪氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ tyrosine transaminase, TAT ） 的 催 化 下 生 成 對(duì) 羥 基 苯 丙 酮 酸（ 4-Hydroxyphenylpyruvate, 4HPP ） ， 然 后 在 丙 酮 酸 脫 羧 酶 (2-keto aciddecarboxylase, KDC)催化下生成 4HPAA，最后還原生成酪醇。需要的大腸桿菌

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 鄧梅;吳振剛;劉雪英;孫曉莉;;紅景天苷及其類(lèi)似物的合成[J];第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2007年16期

本文編號(hào)：2724177