【摘要】：恩拉霉素是一種多肽類抗生素,是殺真菌素鏈霉菌(Streptomycesfungicidicus)經(jīng)過發(fā)酵獲得的次級(jí)代謝產(chǎn)物,可抑制革蘭氏陽性菌生長。恩拉霉素多用于飼料中,可有效提高飼料的利用率,有利于動(dòng)物的增重。恩拉霉素作為飼料添加劑,不易被腸道吸收,可直接排出體外,不會(huì)造成動(dòng)物體內(nèi)抗生素殘留問題;長期使用不易產(chǎn)生耐藥性,也不會(huì)與其它臨床應(yīng)用的抗生素產(chǎn)生交叉耐藥性。因此恩拉霉素是目前僅有的幾種可用于飼料添加劑的抗生素之一,近年來,國內(nèi)外需求有明顯上升趨勢。目前恩拉霉素的生產(chǎn)方式為微生物發(fā)酵法,但其生產(chǎn)過程中普遍存在恩拉霉素產(chǎn)量低、菌株生產(chǎn)穩(wěn)定性差,生產(chǎn)菌種退化嚴(yán)重等問題,因此導(dǎo)致目前國內(nèi)恩拉霉素生產(chǎn)成本一直居高不下。本研究針對(duì)恩拉霉素生產(chǎn)菌產(chǎn)素水平低、退化現(xiàn)象嚴(yán)重等問題,通過分子生物學(xué)等手段將一個(gè)硫鏈絲菌素抗性標(biāo)記基因(tsr ORF)整合至恩拉霉素生物合成基因簇中,使硫鏈絲菌素抗性基因的表達(dá)與恩拉霉素生物合成基因簇中某些關(guān)鍵基因的表達(dá)相連鎖,并通過硫鏈絲菌素高抗性篩選,獲得恩拉霉素生物合成基因穩(wěn)定表達(dá)(或高表達(dá))菌株,即恩拉霉素高產(chǎn)菌株。根據(jù)對(duì)恩拉霉素生物合成基因簇的分析,其中endA、endB、endC、endD是恩拉霉素生物合成過程中負(fù)責(zé)編碼非核糖體多肽合成酶的關(guān)鍵基因。將硫鏈絲菌素抗性基因分別對(duì)齊部分替換這4個(gè)非核糖體多肽聚合酶NRPS基因,通過硫鏈絲菌素抗性篩選獲取菌株具備較大的產(chǎn)素潛力的菌株;最后通過基因回補(bǔ)實(shí)驗(yàn),去除tsr標(biāo)記基因,恢復(fù)原有基因結(jié)構(gòu),從而獲得恩拉霉素高產(chǎn)菌株。但由于該方法需要基因回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)較為繁瑣,于是對(duì)此方法進(jìn)行了進(jìn)一步改進(jìn),將tsr基因插入到nrps基因后,不影響恩拉霉素基因簇的表達(dá),使硫鏈絲菌素抗性基因(tsr)串聯(lián)在nrps基因后使得與恩拉霉素生物合成基因表達(dá)相關(guān)聯(lián)。該方法為恩拉霉素高產(chǎn)菌株的選育提供了一個(gè)篩選標(biāo)記,通過抗性篩選標(biāo)記篩選退化菌株中強(qiáng)壯菌株,解決了傳代過程中造成的菌株不斷退化問題,以及通過抗性篩選獲得高產(chǎn)菌株,此方法大大提高了恩拉霉素高產(chǎn)菌株的篩選效率,該方法是用于恩拉霉素高產(chǎn)菌株定向選育的一個(gè)新方法。本實(shí)驗(yàn)還通過對(duì)恩拉霉素生物合成過程中的調(diào)控基因進(jìn)行研究,通過基因敲除方法分析調(diào)控基因?qū)Χ骼顾睾铣傻挠绊?通過對(duì)正調(diào)控基因過表達(dá)的方法達(dá)到提高恩拉霉素的產(chǎn)量。構(gòu)建的過表達(dá)菌株平均效價(jià)為4380 U/mL,出發(fā)菌株S.fun TCCC F110發(fā)酵液的效價(jià)為3868 U/mL,過表達(dá)菌株產(chǎn)恩拉霉素能力比S.fun TCCC F110株提高了 13.24%。
【圖文】：

手段對(duì)恩拉霉素生產(chǎn)菌株進(jìn)行改造提供了依據(jù)。恩拉霉素生物合成基因簇長８４邋ｋｂ左逡逑右，２５個(gè)開放閱讀框，，其中ｗ；／３６、３７、３８、４０四個(gè)開放閱讀框是四個(gè)ＮＲＰＳ基因，逡逑負(fù)責(zé)生物合成大環(huán)骨架［２８］。恩拉霉素生物合成基因簇如圖１－３所示。該圖源于Ｔｈｅ逡逑ｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎ邋ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ邋ｇｅｎｅ邋ｃｌｕｓｔｅｒ邋ｆｒｏｍ邋Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ邋ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ邋４１邋0逡逑0ｒｆ１邋２邐３邐４邋Ｓ邐６邐７邐８邐９邐１０邐１１邐１２邐１３邐１４邐１５邋１Ｓ邋１７邐１８邋１９逡逑Ｃ＝Ｃ＞Ｃ＝Ｃ＞Ｃｃ￡Ｃ＞＜＝３邋［＝＝士ＺＺ＝Ｃ＞＜＝＾ｔ＝＝Ｃ＞ｔ＝＝＞＜Ｃ＝＝＝３Ｃ＝３＜＾３＜Ｃ：＾＝＝＾ｔ＝＝＝＝＞ＣＺ＾Ｃ＝＞＜＾ＺＫ＞＜＝＝＝ｌ逡逑２０邋２１邐２２邐２３邋２４邋２５邋ｍｎｄＲ邋？ｎｄＱ邋？ｎ＜ｉＰ邋２９邐３０邋３１邋３２邋３３邋３４邋３５邐？ｎｄＡ逡逑ｃ＝＝＾ｃ＝＝＝Ｃ＞邋ｔ邋邋邐邐邋ｉ邋＜ｌ＿ｌｌ邋？■■？邋？－邐＞邋Ｉ邋？丨丨丨丨１丨邋＜邋ＩＩＩ邋＿邋ＩＩＩ邋ＩＩ．丨丨丨丨｜丨？�。剑场辏螅螅螅恚螅剑海海螅螅螅蓿掊义希澹睿迹樱洛义希浚恚缅义希常瑰�？ｎｄＯ邐４１邐４２邐４３邐４４邐４Ｓ邐４６邋４７邋４８邐？．．逡逑—二—＾４—＿１邋￣￣￣邐）逡逑圖１－３恩拉霉素生物合成基因簇逡逑Ｆｉｇ．邋１－３邋ｔｈｅ邋ｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎ邋ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ邋ｇｅｎｅ邋ｃｌｕｓｔｅｒ逡逑４逡逑

ｐＭＤ１９（Ｓｉｍｐｌｅ），將連接正確的質(zhì)粒分別用／／／ｍｉｍＡＷｗＩ和五⑶ＲＩＡＹｋ／Ｉ酶切，回收目逡逑的片段；將酶切后回收得到的左右同源臂片段同時(shí)連入經(jīng)反ｏＲＩ和扣Ｍｉｌｌ酶切后的逡逑ｐＫＣｌ邋１３９載體片段，質(zhì)粒的構(gòu)建如圖２－２所示。逡逑廠／／／＂ｄｍ逡逑￡ａ）Ｒｉ逡逑ｉａｃＺ邋ａ邐／／ｍｄ�。欤欤钸娯w邐廠邋ＥｃｏＲｌ逡逑ｙ邐－ｉ－ｊ；＇■邋■■邋－：＇＂■邋■邋？逡逑Ｕ邋ＲＫ２邐ａａｃｐｊ／Ｖ＇邐Ｌ邋■邋Ｒ逡逑Ａｐｒａｍｙｃｉｎ邋■邐＾逡逑＼邐ｐＫＣ１１３９邐Ｉ邐：邐ｒＥｃＭ逡逑＼ｚｙ邋２２逡逑ｐｓＧ５邋曬逡逑—川￣＼邋ｌ邐”逡逑ｆｏｒｉＴ逡逑ｒ邋ｊ逡逑＼邐ｐＫＣ１１３９－２２邐１逡逑＼邐ａａｃ（３）ＩＶＭ逡逑0ｎ邐Ａｐｒａｍｙｃｉｒ＾Ｆ逡逑圖２－２重組質(zhì)粒ｐＫＣｌ邋１３９－２２逡逑Ｆｉｇ．邋２－２邋Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ邋ｐｌａｓｍｉｄ邋ｐＫＣｌ邋１３９－２２逡逑２．２．７邐ＥＴ１２５６７邋＾邋Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ邋ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ逡逑２．２．７．１鏈霉菌孢子懸液制｝備逡逑將５７ｒｅ／？／ｏｗ＞ｒｅ５／ｗ？ｇ／ｃＷｃｗｓ接種于ＭＳ固體培養(yǎng)基，２８°Ｃ培養(yǎng)５－７ｄ。待孢子成逡逑熟后，用２ｘＹＴ液體培養(yǎng)基洗下孢子，用玻璃珠打散孢子，用過濾器除去雜質(zhì)和菌絲逡逑體
【學(xué)位授予單位】：天津科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：TQ927

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本文編號(hào)：2708097