【摘要】：近年來,隨著上游抗體細(xì)胞表達(dá)技術(shù)的提高和培養(yǎng)規(guī)模的擴(kuò)大,以及抗體藥物的高純度要求和分離純化工藝的復(fù)雜性,蛋白A親和層析作為下游抗體捕獲的平臺技術(shù),因價(jià)格昂貴、洗脫苛刻、介質(zhì)利用率低等不足限制了其在抗體大規(guī)模分離純化的應(yīng)用。短肽仿生親和層析作為一種新型的抗體分離層析技術(shù),因其低成本、高穩(wěn)定性、低免疫原性、高選擇性和洗脫條件溫和等優(yōu)點(diǎn),是潛在的蛋白A親和層析的替代技術(shù),具有良好的應(yīng)用前景。為了進(jìn)一步提高短肽仿生層析介質(zhì)的動(dòng)態(tài)結(jié)合載量,引入葡聚糖接枝制備高載量的葡聚糖接枝型短肽親和層析介質(zhì)以提高介質(zhì)對目標(biāo)蛋白的平衡吸附容量和傳質(zhì)速率是改善介質(zhì)性能的新途徑。本文主要研究了葡聚糖接枝型四肽仿生層析介質(zhì)的制備及其抗體吸附性能和分離性能,并對比非接枝四肽仿生層析介質(zhì)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,分析葡聚糖接枝對短肽仿生層析的影響,為短肽仿生層析介質(zhì)的改進(jìn)提供新思路。本文的主要研究內(nèi)容和取得的結(jié)果如下:首先以Ac-YFRH為功能配基,交聯(lián)葡聚糖瓊脂糖基質(zhì)Bestarose XL為基質(zhì),采用HATU法制備了不同配基密度的葡聚糖接枝型四肽仿生層析介質(zhì)Ac-YFRH-XL,考察了介質(zhì)對hIgG、BSA和Fc融合蛋白的靜態(tài)吸附性能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Ac-YFRH-XL介質(zhì)對hIgG的吸附是疏水相互作用和靜電相互作用共同主導(dǎo),在pH 9.0時(shí)吸附容量可達(dá)133 mg/g介質(zhì),在pH 5.0無吸附,同時(shí)對氯化鈉和辛酸鈉表現(xiàn)出較好的耐鹽性。Ac-YFRH-XL介質(zhì)對BS A的吸附主要基于靜電相互作用,在pH 5.0時(shí)非特異性吸附最高。相同配基密度的Ac-YFRH-XL介質(zhì)對Fc融合蛋白比hIgG有更高的吸附容量和結(jié)合能力,符合前期基于配基和抗體Fc片段間主要結(jié)合位點(diǎn)的計(jì)算機(jī)模擬結(jié)果。引入葡聚糖接枝可以增加介質(zhì)的配基偶聯(lián)密度從而提高其對抗體的吸附容量和結(jié)合能力,較非接枝四肽層析介質(zhì)有優(yōu)勢。接著考察了葡聚糖接枝型四肽仿生層析介質(zhì)Ac-YFRH-XL對hIgG和BSA的動(dòng)態(tài)吸附性能。結(jié)果表明介質(zhì)在pH9.0時(shí)對hIgG的動(dòng)態(tài)結(jié)合載量(Q10%)可達(dá)36.8mg/mL,約2.5倍于非接枝Ac-YFRH-4FF介質(zhì)的14.9 mg/mL,同時(shí)該條件下介質(zhì)對BSA無吸附。Ac-YFRH-XL介質(zhì)在低鹽條件(NaC1≤0.2 M)下對抗體有較好的結(jié)合能力,高鹽條件下幾乎無吸附,耐鹽性弱于非接枝層析介質(zhì)。此外,在高于非接枝介質(zhì)的最大偶聯(lián)密度的一定配基密度范圍內(nèi),葡聚糖接枝Ac-YFRH-XL介質(zhì)對抗體的結(jié)合載量隨之增加,顯著增加了介質(zhì)在更大規(guī)模分離中的應(yīng)用潛力。最后探究了葡聚糖接枝Ac-YFRH-XL介質(zhì)對實(shí)際料液體系的分離性能。在pH9.0條件下從混合蛋白(hIgG:BSA=1:4)體系中分離hIgG得到抗體的純度和收率分別為98.7%和89%;在pH9.0條件下從CHO培養(yǎng)上清液中分離單抗得到單抗純度和收率分別為93.0%和84.7%,相較于非接枝Ac-YFRH-4FF介質(zhì)具有相似的分離效率,但葡聚糖接枝Ac-YFRH-XL介質(zhì)能達(dá)到更高的處理量,顯示了其在更大規(guī)模體系中的分離潛力。
【圖文】：

（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ，，ＩｇＧ）作為主要的血清抗體組成部分，其比例高達(dá)７５？８０°／0［１４］。逡逑１．２．１抗體的結(jié)構(gòu)逡逑如圖１．１所示，抗體本身由兩條完全相同的重鏈（Ｈｅａｖｙ邋ｃｈａｉｎ，Ｈ鏈）和兩逡逑條相同的輕鏈（Ｌｉｇｈｔ邋ｃｈａｉｎ，邋Ｌ鏈）通過四對二硫鍵相連且呈現(xiàn)Ｙ字型的基本結(jié)逡逑構(gòu)。ＩｇＧ的分子量約為１５０邋ｋＤａ，其中兩條重鏈約為５０邋ｋＤａ，兩條輕鏈約為２５逡逑ｋＤａ［１５，１６］。ＩｇＧ的可變區(qū)位于重鏈和輕鏈的Ｎ端，該區(qū)域氨基酸序列變化較大，逡逑在重鏈和輕鏈所占的比例分別為２５％和５０％；邋ＩｇＧ的恒定區(qū)則位于氨基酸序列更逡逑穩(wěn)定的Ｃ端，一般分為ＣＨＩ，邋ＣＨ２和ＣＨ３。在ＣＨ１與ＣＨ２之間存在鉸鏈區(qū)，逡逑２逡逑

邋＾邋ｕ逡逑Ｃ端逡逑圖１．１邋ＩｇＧ的結(jié)構(gòu)示意圖逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．１邋Ｉｌｌｕｓｔｒａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＩｇＧ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ逡逑１．２．２抗體的應(yīng)用逡逑抗體因其獨(dú)特的生物活性而被廣泛應(yīng)用于生物技術(shù)領(lǐng)域和臨床醫(yī)療領(lǐng)域，其逡逑主要的生物活性特點(diǎn)包括：（１）抗原特異性結(jié)合：在機(jī)體內(nèi)特異性結(jié)合外源毒素逡逑或病毒，介導(dǎo)免疫應(yīng)答反應(yīng)，促使抗體抗原復(fù)合物被巨噬細(xì)胞吞噬；（２）激活補(bǔ)逡逑體？．激活補(bǔ)體的經(jīng)典途徑可以通過ＩｇＧ的構(gòu)型變化所暴露出的ＣＨ２／ＣＨ３的相關(guān)逡逑３逡逑
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：TQ464;O658.1

【參考文獻(xiàn)】

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1 侯越;羅奮華;吳應(yīng)積;;抗體分離純化技術(shù)的研究進(jìn)展[J];生物技術(shù)通報(bào);2008年03期

2 侯盛;郭亞軍;;單克隆抗體在腫瘤治療中的應(yīng)用[J];中國處方藥;2007年04期

3 姚曉玲;柳曉燕;吳強(qiáng);徐振山;宋禮華;;人肺癌相關(guān)單克隆抗體的制備及其抗原的純化[J];中國免疫學(xué)雜志;2006年12期

4 馬義才,賈桂芳,周瓊秀,鄭鵬,劉福榮,季陽;五種艾滋病病毒抗體診斷試劑臨床質(zhì)量比較[J];中國艾滋病性病;2002年04期

5 莊輝,崔怡輝,朱萬孚,朱永紅,徐國民;戊型肝炎病毒IgG抗體酶聯(lián)免疫診斷試劑盒研制[J];中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志;2001年05期

6 黃嘉陵;;用于純化抗原性物質(zhì)的單克隆抗體親和層析術(shù)(一)[J];細(xì)胞生物學(xué)雜志;1985年01期

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1 劉韜;聚合物接枝型疏水性電荷誘導(dǎo)層析介質(zhì)設(shè)計(jì)及蛋白質(zhì)吸附機(jī)理研究[D];浙江大學(xué);2017年

2 王榮柱;以四肽為配基的仿生層析和抗體的分離純化[D];浙江大學(xué);2015年

3 童紅飛;新型疏水性電荷誘導(dǎo)配基設(shè)計(jì)及層析分離抗體研究[D];浙江大學(xué);2014年

本文編號：2695471