【摘要】：益生元多為一種在胃腸道上段不易消化的碳水化合物,它通過對菌群結構的調節(jié)來產(chǎn)生有利于人體健康的作用。益生元已被報道具有多種生理功能,例如通便、抗癌、促進礦物質吸收、調節(jié)脂質代謝和改善免疫作用的健康功效等。目前體外評估益生元的方式主要有兩種1)體外發(fā)酵模型;2)體外細胞模型。通過上述兩種模型的結合,我們不僅可以觀察益生元對發(fā)酵菌群結構以代謝產(chǎn)物的調整,而且可以揭示發(fā)酵產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物的生理功效。然而,在使用細胞模型方面仍存在稍許不足:首先,現(xiàn)有測定方法無法實現(xiàn)對細胞反應的動態(tài)監(jiān)測;其次,關鍵的實驗因素如上樣體積和作用時間尚未確定。為了解決上述不足,本研究引進一種新的技術平臺——細胞實時功能分析(RTCA SP)系統(tǒng)。該系統(tǒng)的核心是底部整合有微電子傳感器的細胞檢測板。細胞反應以基于微電極阻抗的細胞指數(shù)的形式呈現(xiàn)。它具有實現(xiàn)數(shù)據(jù)自動采集和實時分析的優(yōu)勢。為了標準化基于RTCA SP系統(tǒng)以Caco-2細胞模型評估益生元時的上樣體積以及作用時間,我們設計了如下實驗:1)測定3種不同SCFAs混合液對Caco-2細胞生長的影響;2)對低聚果糖(FOS)和抗性淀粉(RS)發(fā)酵上清的動態(tài)測定。我們發(fā)現(xiàn)Caco-2細胞對SCFAs混合液的耐受范圍為0-8 mmol/L。據(jù)此設定益生元發(fā)酵上清的上樣體積為6.3%(v/v)。我們也發(fā)現(xiàn)益生元發(fā)酵上清作用于Caco-2細胞生長模型和腸屏障模型的時間范圍分別是0-16h和0-72h。所以在比較FOS和RS的生理功效時我們挑取的數(shù)據(jù)分別來自16h(Caco-2細胞生長)和72h(Caco-2單細胞層屏障功能)。FOS和RS在兩種營養(yǎng)條件下(PBS體系和BCM體系)與新鮮糞便進行厭氧發(fā)酵。采用RTCA SP系統(tǒng)以及上述實驗參數(shù)評估FOS和RS的發(fā)酵上清。我們發(fā)現(xiàn)FOS和RS均可以刺激Caco-2細胞生長和增強Caco-2單細胞層屏障功能;特別是在PBS體系,FOS和RS(發(fā)酵24h和72h)的上清可以顯著地促進Caco-2細胞生長。為了驗證上述結果的準確性,我們對對響應益生元的關鍵OTUs豐度以及發(fā)酵上清中SCFAs的含量進行分析。結果發(fā)現(xiàn)FOS和RS發(fā)酵上清的生理功能同益生元富集的SCFAs產(chǎn)生菌Faecalibacterium和Roseburia呈顯著正相關;同潛在致病菌Oscillibacter,Bilophila,Escherichia/Shigella和Streptococcus呈顯著負相關。FOS和RS發(fā)酵上清對Caco-2單細胞層屏障功能的增強作用同乙酸、丙酸、丁酸和總酸的含量呈顯著正相關;同異丁酸的含量呈負相關。綜上所述,本研究將RTCA SP系統(tǒng)引入到對益生元發(fā)酵上清作用效果的評估中,并確定了Caco-2細胞模型在該系統(tǒng)中的評估體系的上樣體積和作用時間,在此基礎上對FOS和RS發(fā)酵上清的生理功效了進行評估。根據(jù)FOS和RS發(fā)酵上清的生理功效與發(fā)酵液的菌群結構的改變及發(fā)酵上清中SCFAs含量的關聯(lián)分析,揭示了FOS和RS通過調整發(fā)酵菌群的群落結構而影響其代謝產(chǎn)物,進而刺激Caco-2細胞生長和增強Caco-2單細胞層屏障功能。本研究表明了利用RTCA SP系統(tǒng)對益生元作用功效進行體外評估的可靠性。
【圖文】：

圖 1-1 . SCFAs 發(fā)揮作用的主要途徑。Figure1-1 Fermentation of dietary fiber leads to the production of SCFAs via various biochemical pathwahe size of the letters symbolizes the ratio of SCFAs present. In the distal gut, SCFAs can enter the cells throiffusion or SLC5A8-mediated transport and act as an energy source or an HDAC inhibitor. Luminal acetatropionate sensed by GPR41 and GPR43 releases PYY and GLP-1, affecting satiety and intestinal tranuminal butyrate exerts anti-inflammatory effects via GPR109A and HDAC inhibition. Furthermore, propionan be converted into glucose by IGN, leading to satiety and decreased hepatic glucose production. SCFAs lso act on other sites in the gut, like the ENS, where they stimulate motility and secretory activity, or the immells in the lamina propria, where they reduce inflammation and tumorigenesis. Small amounts of SCFAs (mocetate and possibly propionate) reach the circulation and can also directly affect the adipose tissue, brain, ver, inducing overall beneficial metabolic effects. Solid arrows indicate the direct action of each SCFA, ashed arrows from the gut are indirect effects.乙酸是可以到達外周循環(huán)的含量最豐富的 SCFAs，最近報道可以跨過血腦屏障被腦從而直接影響飲食控制中樞[15]。它主要是和 GPR43 結合，，在代謝上抑制脂類分解[15加胰島素敏感性[16]和能量消耗、促進 PYY 和 GLP-1 的分泌、前體脂肪細胞的分化和控制[17,18]；在癌癥和 IBD 方面可以防治 IBD、在結腸炎動物模型中減輕炎癥和促進腸癌細胞的凋亡；免疫方面

健康個體 BMP 組和 BME 組丁酸的濃度無顯著性差異，但在 2 型糖尿病個體中則恰恰相反(圖 1C; 圖 1D; 圖1E; 圖 1H; 圖 1I; 圖 1J)。圖 1 苦瓜制品發(fā)酵上清 pH 和 SCFAs 濃度的測定。A-E：健康個體；F-J：2 型糖尿病個體。相同字母表示組內(nèi)無顯著性差異(p>0.05, 單因素方差分析, Tukey 后檢驗)Figure 1 Determination of pH and SCFAs concentrations in the fermentation supernatant of bitter melon preparations. A -EHealthy individual; F-J T2D patient. Same letter represents no significant difference within the group (p >0.05, One-Way ANOVA，
【學位授予單位】：上海交通大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：TQ920.1

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本文編號：2664604