【摘要】：抗體作為臨床應(yīng)用最廣泛的治療性蛋白藥物,主要是通過CHO(Chinese Hamster Ovary)細(xì)胞培養(yǎng)來表達(dá)生產(chǎn)。與前一代的生物技術(shù)產(chǎn)品如細(xì)胞因子類藥物相比,抗體類生物藥的主要特點是臨床用藥劑量大,因此需要大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)來滿足市場需求,而CHO細(xì)胞培養(yǎng)的工藝優(yōu)化和規(guī)模放大具有較大挑戰(zhàn)性。提高細(xì)胞培養(yǎng)工藝表達(dá)量,擴(kuò)大細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)規(guī)模,保證表達(dá)抗體質(zhì)量穩(wěn)定成為目前國內(nèi)抗體產(chǎn)業(yè)界在抗體類蛋白藥物規(guī)模生產(chǎn)過程中亟待解決的問題。本文圍繞著以上問題,系統(tǒng)研究了CHO細(xì)胞的流加培養(yǎng)小試工藝優(yōu)化,中試和產(chǎn)業(yè)化規(guī)模工藝放大,并探索性開發(fā)了基于切向流換液(ATF)技術(shù)的濃縮灌流工藝,以進(jìn)一步提升我國抗體類藥物規(guī)模產(chǎn)能。首先考察了培養(yǎng)基中金屬離子的濃度對抗體質(zhì)量的影響,培養(yǎng)基中將銅離子濃度從1000 nM降低到500 nM時,抗體產(chǎn)物MAb A的生產(chǎn)細(xì)胞可以維持1.2×107 vc/mL密度的生長,抗體產(chǎn)量保持不變,電荷異構(gòu)體中堿性異構(gòu)體的比例明顯降低。說明銅離子作為多種酶的輔因子,除了維持細(xì)胞生長代謝,還會對C-端脯氨酸酰胺化產(chǎn)生影響。在攪拌式反應(yīng)器培養(yǎng)抗體MAb A生產(chǎn)細(xì)胞時,將溶氧從60%降低至20%,細(xì)胞生長及抗體產(chǎn)量沒有明顯變化,抗體N-糖基化中G0F 比例明顯升高,G1F 比例明顯降低,說明溶氧水平對半乳糖糖基化有明顯影響。另一方面延長培養(yǎng)時間觀察到抗體酸性異構(gòu)體比例明顯上升,主要原因是培養(yǎng)液環(huán)境中自由基和氧化還原作用對抗體理化性質(zhì)的穩(wěn)定性存在一定影響。隨后基于機(jī)械攪拌鼓泡式反應(yīng)器內(nèi)氣-液傳質(zhì)理論,開發(fā)了一套動物細(xì)胞反應(yīng)器傳質(zhì)模型。此模型結(jié)合了反應(yīng)器傳質(zhì)屬性和細(xì)胞培養(yǎng)代謝參數(shù)對細(xì)胞在大規(guī)模反應(yīng)器培養(yǎng)過程中的氧氣需求和二氧化碳累積水平做出了預(yù)測。在此模型的指導(dǎo)下,MAb A細(xì)胞培養(yǎng)工藝從2L實驗室規(guī)模一次性放大到了1500L產(chǎn)業(yè)化規(guī)模,最終細(xì)胞生長、抗體產(chǎn)量和抗體質(zhì)量在小試規(guī)模和商業(yè)化生產(chǎn)規(guī)模之間保持了一致。針對傳統(tǒng)CHO細(xì)胞流加培養(yǎng)條件下由于細(xì)胞代謝廢物積累造成抗體產(chǎn)量難以進(jìn)一步大幅提高的問題,我們開發(fā)了基于切向流過濾換液ATF系統(tǒng)的CHO細(xì)胞濃縮灌流培養(yǎng)工藝。在濃縮灌流培養(yǎng)工藝的優(yōu)化過程中,培養(yǎng)液中游離氨基酸濃度的檢測起了很重要的作用,為灌流培養(yǎng)基配方的優(yōu)化及灌流速率的調(diào)整提供了依據(jù)。最終通過濃縮灌流培養(yǎng)工藝,MAb A細(xì)胞生長密度提高了7.5倍,抗體產(chǎn)量提高了7.7倍。
【圖文】：

制藥總銷售額（不包括疫苗）的近６６％。逡逑２０１８年十大最暢銷的生物制藥包括八種抗體（六種單克隆抗體和兩種逡逑基于Ｆｃ的融合蛋白）（圖１．２）。用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和相關(guān)疾病的逡逑ＴＮＦ－ａ抑制劑，第一個單克隆抗體阿達(dá)木單克隆抗體（商品名Ｈｕｍｉｒａ）在逡逑此榜單中名列第一，，創(chuàng)造了邋１９９．３６億美元的收入。逡逑４逡逑

Ｆｉｇｕｒｅ邋１．２邋Ｔｏｐ邋１０邋ｇｌｏｂａｌ邋ｓａｌｅｓ邋ｏｆ邋ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ逡逑１．１．３國內(nèi)抗體規(guī)模生產(chǎn)逡逑隨著國家在生命科學(xué)和生物醫(yī)藥領(lǐng)域的大力投入，我國在生物新藥創(chuàng)制的上逡逑游領(lǐng)域己經(jīng)逐漸和國際接軌并形成了自己的技術(shù)特色。在抗體和融合蛋白領(lǐng)域，逡逑國內(nèi)很多實驗室己經(jīng)積累了一批具有自主知識產(chǎn)權(quán)的創(chuàng)新藥和改進(jìn)藥。但是如何逡逑將實驗室中的創(chuàng)新轉(zhuǎn)換成產(chǎn)品的問題還有待解決，特別是抗體藥物的規(guī)模生產(chǎn)和逡逑質(zhì)量控制技術(shù)目前已成為嚴(yán)重制約我國抗體產(chǎn)業(yè)發(fā)展的技術(shù)瓶頸。高表達(dá)細(xì)胞系逡逑的建立和高效培養(yǎng)基及培養(yǎng)工藝的開發(fā)、高效純化工藝和制劑配方的開發(fā)、質(zhì)檢逡逑系統(tǒng)的建立和分析方法的開發(fā)等一系列核心技術(shù)是抗體藥物產(chǎn)業(yè)化中亟需解決逡逑的關(guān)鍵技術(shù)，只有提高抗體產(chǎn)量和質(zhì)量并進(jìn)行大規(guī)模的生產(chǎn)，才能將更多的在研逡逑抗體項目從實驗室推向臨床并早日獲得市場準(zhǔn)入，為廣大患者造福。逡逑單克隆抗體藥物由于其特異性強(qiáng)、臨床研究的成功率高于小分子藥物的優(yōu)勢逡逑
【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)院大學(xué)(中國科學(xué)院過程工程研究所)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：TQ460.6

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本文編號：2662053