【摘要】：丁醇作為最具潛力的新型清潔燃料之一具有熱值與汽油相當(dāng)、容易運輸、燃燒無污染等優(yōu)點。在丁醇的各種生產(chǎn)方法中,微生物發(fā)酵法(ABE發(fā)酵)因具有環(huán)保清潔、不需要使用催化劑、反應(yīng)條件溫和等優(yōu)勢而成為主要研究方法。拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii NCIMB 8052)具有底物適應(yīng)譜廣、遺傳性狀穩(wěn)定等優(yōu)點,是ABE發(fā)酵的常用菌株,但是,其丁醇產(chǎn)量低是一直沒有突破的瓶頸,而CoA轉(zhuǎn)移酶是啟動梭菌溶劑合成途徑的關(guān)鍵酶,在梭菌中過表達該酶對提升梭菌的丁醇產(chǎn)量具有重要意義。因此,本文利用課題組保藏的C.beijerinckii NCIMB 8052,構(gòu)建了CoA轉(zhuǎn)移酶過表達基因工程菌,并對其進行了發(fā)酵性能分析。主要研究結(jié)果如下:(1)構(gòu)建了CoA轉(zhuǎn)移酶過表達基因工程菌。設(shè)計了CoA轉(zhuǎn)移酶基因ctfAB特異性引物,以C.beijerinckii NCIMB 8052基因組為模板,擴增得到了ctfAB片段,將其與pMD-19T進行了連接,完成了T/A克隆,測序驗證無誤后,將經(jīng)過Bsr GI和HindIII雙酶切的ctfAB片段和載體pMTL007進行了連接,構(gòu)建了CoA轉(zhuǎn)移酶過表達載體pMTL007-ctfAB,并將其電轉(zhuǎn)化入C.beijerinckii NCIMB 8052中,通過菌落PCR和SDS-PAGE電泳驗證實驗,證實CoA轉(zhuǎn)移酶過表達基因工程菌構(gòu)建成功;(2)對工程菌進行了發(fā)酵性能分析。工程菌和野生菌進行了分批搖瓶發(fā)酵,分別對兩者的發(fā)酵液pH值、發(fā)酵液殘?zhí)橇�、菌體生物量和溶劑產(chǎn)量進行了檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn):工程菌提前進入產(chǎn)溶劑期,其pH值比野生菌提前出現(xiàn)上升趨勢;在發(fā)酵12-24h這一時段內(nèi),工程菌的糖消耗速率比野生菌提高15%,工程菌最終發(fā)酵液殘?zhí)橇勘纫吧档?3.3%;發(fā)酵進行到18 h時,工程菌進入穩(wěn)定期,野生菌則繼續(xù)生長,生長速度超過工程菌,野生菌的最大菌體生物量大于工程菌;工程菌最高丁醇產(chǎn)量達11.53±0.63 g/L,比野生菌提高4.5%,總?cè)軇┳罡弋a(chǎn)量達16.84±0.77 g/L,比野生菌提高4.2%。本研究成功構(gòu)建了C.beijerinckii NCIMB 8052的CoA轉(zhuǎn)移酶過表達基因工程菌,為在C.beijerinckii NCIMB 8052中進一步開展CoA轉(zhuǎn)移酶的研究提供了一種可能,也為提高ABE發(fā)酵的丁醇產(chǎn)量提供了一種途徑。
【圖文】：

圖 2-1 ctfAB 基因片段 PCR 擴增結(jié)果Marker：DNA Marker III；泳道 2-8：ctfAB 基因片段Fig 2-1 The result of PCR amplification for ctfAB gene sequenceMarker：DNA Marker III；Lane2 to 8：ctfAB gene sequence

27 2-2 ctfAB 基因片段膠回收 III；泳道 ctfAB gene：回收l purification of ctfAB gene seLane ctfAB gene：The purifie隆糖凝膠電泳檢測結(jié)果如圖帶，轉(zhuǎn)化效率較高。經(jīng)
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：TQ923;TQ223.124

【參考文獻】

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本文編號：2639836