【摘要】：麥芽糖淀粉酶,又稱生麥芽糖α-淀粉酶(Maltogenicα-amylase),能水解麥芽三糖、淀粉及部分糊精生成麥芽糖,可用于淀粉糖化、食品烘焙、面粉改性等領(lǐng)域。尤其在食品烘焙方面,能夠水解面包中的淀粉,防止淀粉顆粒與蛋白質(zhì)形成鉸鏈,延長(zhǎng)商品的貨架期,應(yīng)用效果良好。本研究構(gòu)建了含B.stearothermophilus麥芽糖淀粉酶基因的重組質(zhì)粒amyM/pHY300PLK,并在此質(zhì)粒上對(duì)啟動(dòng)子和信號(hào)肽進(jìn)行優(yōu)化,轉(zhuǎn)入食品安全菌株枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)中進(jìn)行重組表達(dá)。同時(shí)研究了重組酶的酶學(xué)性質(zhì),在搖瓶及3-L罐水平上進(jìn)行發(fā)酵優(yōu)化,提高了麥芽糖淀粉酶的表達(dá)水平。主要研究結(jié)果如下:(1)構(gòu)建了含B.stearothermophilus麥芽糖淀粉酶基因的重組質(zhì)粒 amyM/pHY300PLK。在此質(zhì)�；A(chǔ)上,研究了7個(gè)組成型啟動(dòng)子(amyE_((B.S))、amyE、aprE、gsiB、HpaII、SrfA、xyl A_((B.S)))及2個(gè)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(xylA、ManP)對(duì)麥芽糖淀粉酶在枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis中表達(dá)的影響。結(jié)果表明,以amyE_((B.S))為啟動(dòng)子,33℃下在TB培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶發(fā)酵48 h,麥芽糖淀粉酶表達(dá)最好,酶活最高為145.8 U·m L~(-1)。(2)通過Takara信號(hào)肽篩選系統(tǒng)中商品化的載體pEB-S及Bacillus subtilis RIK1285宿主菌,從173種信號(hào)肽中篩選出三株使麥芽糖淀粉酶表達(dá)量高的信號(hào)肽。鑒定其信號(hào)肽,分別為引導(dǎo)目的蛋白從Sec途徑分泌的YvcE、YncM信號(hào)肽和引導(dǎo)目的蛋白從Tat途徑分泌的LipA信號(hào)肽。將這些信號(hào)肽與含amyE_((B.S))啟動(dòng)子的表達(dá)載體進(jìn)行重組,并轉(zhuǎn)入Bacillus subtilis CCTCC M 2016536表達(dá)宿主中進(jìn)行麥芽糖淀粉酶的表達(dá)。結(jié)果表明,分別以YvcE、YncM及LipA作為信號(hào)肽時(shí),在33℃下,以TB培養(yǎng)基進(jìn)行搖瓶發(fā)酵48 h,酶活分別為250.7 U·m L~(-1)、194.8 U·mL~(-1)及189.2 U·m L~(-1),是未更換信號(hào)肽前的1.72、1.33及1.29倍。(3)考察重組麥芽糖淀粉酶的酶學(xué)性質(zhì),結(jié)果表明,以可溶性淀粉為底物,麥芽糖淀粉酶淀粉水解比活力為2646 U·g~(-1),K_m為0.95 g·L~(-1),k_(cat)/K_m為12640.4 s~(-1)·g·L~(-1)。重組酶的最適反應(yīng)pH為5.5,最適溫度為60℃。在60℃下進(jìn)行熱穩(wěn)定性的考察,結(jié)果表明重組酶非常穩(wěn)定,半衰期長(zhǎng)達(dá)325 h。(4)對(duì)重組菌進(jìn)行發(fā)酵優(yōu)化,首先在搖瓶水平上對(duì)重組菌進(jìn)行培養(yǎng)基組成的優(yōu)化,結(jié)果表明最佳培養(yǎng)基成分為:酵母浸膏25 g·L~(-1)和大豆蛋白胨5 g·L~(-1)、葡萄糖5 g·L~(-1)、Fe~(3+)1 mmol·L~(-1)。在此條件下,搖瓶發(fā)酵48 h后麥芽糖淀粉酶酶活為371.7 U·m L~(-1)。以搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ),在3-L罐水平上優(yōu)化了重組菌發(fā)酵產(chǎn)酶的條件。結(jié)果表明,在37℃下,以葡萄糖作為補(bǔ)料培養(yǎng)基中碳源,以酵母浸膏為氮源,C/N比為1:1下進(jìn)行發(fā)酵,麥芽糖淀粉酶酶活最高為2273.6 U·mL~(-1)。
【圖文】：

圖 1-1 麥芽糖淀粉酶的水解及轉(zhuǎn)糖苷作用Fig. 1-1 Hydrolysis and transglycosylation of maltogenic amylase人[9]在 1999 年將 B. stearothermophilus 麥芽糖淀粉酶的結(jié)構(gòu)解析芽糖淀粉酶在結(jié)構(gòu)上有與其他糖苷水解酶 GH13 家族成員同樣的

麥芽糖淀粉酶的主要來源 ，包括嗜熱脂s)[11]、蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)[12]、地綠色糖單孢菌(Saccharomonospora viridis)[14-15]、喜熱裂孢菌(Thermobifida fusca)[17]、枯草芽孢桿桿菌是一種嗜熱性需氧芽孢桿菌，兼性厭氧，對(duì)評(píng)價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)菌株，其最高生長(zhǎng)溫度可達(dá) 80℃左來源的麥芽糖淀粉酶，，在性質(zhì)上也有很大的區(qū)別糖淀粉酶在細(xì)菌麥芽糖淀粉酶中因溫度穩(wěn)定性最0]。酶的應(yīng)用酶作為一種新型的酶制劑，主要用于淀粉糖化、食圖 1-2 B. stearothermophilus 麥芽糖淀粉酶的蛋白質(zhì)三維Fig. 1-2 Structure of B. stearothermophilus maltogenic amy
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：TQ925.1

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本文編號(hào)：2635500