發(fā)布時間：2020-04-20 00:11

【摘要】：隨著經(jīng)濟的發(fā)展與科技的進步,人們對生活品質(zhì)要求日益提高,而全球環(huán)境尤其是海洋環(huán)境問題日益凸顯。海洋紅酵母作為海洋環(huán)境中一類抗逆性極強的優(yōu)勢菌群,菌體營養(yǎng)成分豐富,能夠代謝包括蝦青素在內(nèi)的多種類胡蘿卜素,且具有降解石油化合物及凈化水體等多種生理功能,近年來成為研究熱點。蝦青素因其具備極強的抗氧化、衰老能力,以及著色功能,在食品、醫(yī)藥、化妝品等行業(yè)有廣闊的應(yīng)用前景。蝦青素等類胡蘿卜素?zé)o法在動物體內(nèi)自發(fā)生成,目前微生物是類胡蘿卜素獲取的良好來源。海洋紅酵母能夠代謝產(chǎn)生大量類胡蘿卜素,且具備發(fā)酵條件簡單、生長周期短等特點,因此,本研究以極地海洋紅酵母Rhodotorula sp.為目標,探究其高效液相色譜洗脫條件,優(yōu)化其發(fā)酵培養(yǎng)方式,分離純化其代謝產(chǎn)物以及對代謝產(chǎn)物的生物活性進行了研究。首先是高效液相色譜洗脫條件的確立。采用高效液相色譜法對海洋紅酵母Rhodotorula sp.的代謝產(chǎn)物進行分析測定。對乙酸銨甲醇和甲酸乙腈兩個體系進行擇優(yōu)選取,通過不同時間及流動相配比的反復(fù)調(diào)試分析,最終確立了最優(yōu)的梯度分離條件:50 m M乙酸銨和甲醇體系(0-15 min:1%甲醇,99%50 m M乙酸銨;15-60 min:60%甲醇,40%50 m M乙酸銨),檢測波長265 nm,流速1 m L/min,柱溫35℃,安譜C18柱(25 mm×4.6 mm,5μm),進樣量10μL。對發(fā)酵液的制備方式進行了研究,通過對原始發(fā)酵液、上清液發(fā)酵液以及菌體發(fā)酵液進行高效液相色譜分析,最終采用處理方式為:在原始發(fā)酵液中加入適量甲醇,使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將其濃縮制備成待測樣品。其次是海洋紅酵母Rhodotorula sp.主要代謝產(chǎn)物的確定以及優(yōu)化其發(fā)酵培養(yǎng)條件。對蝦青素標準溶液進行高效液相色譜分析,初步進行推斷其主要代謝產(chǎn)物即第19.4 min中出峰的代謝產(chǎn)物為蝦青素。進一步通過質(zhì)譜分析以及核磁共振分析,確定海洋紅酵母Rhodotorula sp.的主要代謝產(chǎn)物是蝦青素,產(chǎn)量為18.6mg/m L。對其產(chǎn)蝦青素的發(fā)酵培養(yǎng)條件進行優(yōu)化,通過單因素實驗表明,海洋紅酵母Rhodotorula sp.發(fā)酵生成蝦青素的最優(yōu)乙酰水楊酸的添加量為100.00 mg/L,最優(yōu)硫酸鋅的添加量為100.00 mg/L,最優(yōu)發(fā)酵時間為5天。采用響應(yīng)面法對海洋紅酵母Rhodotorula sp.產(chǎn)蝦青素發(fā)酵培養(yǎng)條件進行優(yōu)化,建立了海洋紅酵母Rhodotorula sp.發(fā)酵培養(yǎng)條件的回歸模型,對回歸方程求解,當蝦青素產(chǎn)量達到最大值27.00 mg/m L時,發(fā)酵時間為6.64天,硫酸鋅添加量為113.50 mg/L,乙酰水楊酸添加量為111.00 mg/L。為方便實際操作,由該模型優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)條件為:發(fā)酵時間為6天,硫酸鋅添加量為113.00 mg/L,乙酰水楊酸添加量為111.00 mg/L。此條件下,蝦青素產(chǎn)量為28.40 mg/m L,與模型預(yù)測相近,進一步驗證了該模型的可靠性。經(jīng)過優(yōu)化后的蝦青素產(chǎn)量提高了52.7%。最優(yōu)的海洋紅酵母Rhodotorula sp.產(chǎn)蝦青素的發(fā)酵條件為:活化培養(yǎng)基:葡萄糖(20 g/L),牛肉膏蛋白胨(10 g/L),酵母提取物(5 g/L),氯化鈉(10 g/L),硫酸鎂(3 g/L),磷酸氫二鉀(7 g/L),活化1天。發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖(20 g/L),牛肉膏蛋白胨(10 g/L),酵母提取物(15 g/L),氯化鈉(10 g/L),硫酸鎂(0.15 g/L),磷酸氫二鉀(0.25 g/L),吐溫(1 g/L),硫酸鋅(113 mg/L),乙酰水楊酸(111 mg/L),發(fā)酵6天。最后是對海洋紅酵母Rhodotorula sp.的代謝產(chǎn)物進行分離純化以及對代謝產(chǎn)物的生物活性進行相關(guān)研究。使用制備型高效液相色譜,分離純化得到了5種代謝產(chǎn)物,使用高效液相色譜、質(zhì)譜以及核磁共振分析,明確了這5種化合物是蝦青素的不同構(gòu)型。對海洋紅酵母Rhodotorula sp.的主要代謝產(chǎn)物蝦青素進行了纖溶活性評價、DPPH自由基清除能力評價、羥自由基清除能力評價、超氧陰離子清除能力評價、紅外光譜分析以及紫外波長吸光度分析。海洋紅酵母Rhodotorula sp.代謝產(chǎn)生并分離純化得到的蝦青素不具備纖溶活性能力;稀有的極地海洋紅酵母來源的蝦青素具有較高的抗氧化活性。在清除DPPH自由基方面,其清除能力在低濃度時次于維生素C,在高濃度時與維生素C相當,顯著優(yōu)于海洋紅球藻源蝦青素和維生素E;在清除羥自由基與超氧陰離子方面,其清除能力顯著優(yōu)于Vc、Ve和AXH。極地海洋紅酵母來源的蝦青素的抗氧化活性優(yōu)良,且優(yōu)于Vc、Ve和AXH;在紅外光譜中,由于蝦青素結(jié)構(gòu)中的C=O鍵、芳香族里的C=C鍵以及C-C共軛體系中的C-H鍵的伸縮振動從而形成了3個明顯的吸收峰;通過紫外分光光度計在200-600 nm處對蝦青素的吸光度的掃描,得到蝦青素在480nm出有最大特征性吸收。
【圖文】：

上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文2.2.3 海洋紅酵母（Rhodotorula sp.）的 HPLC 條件的優(yōu)化采用高效液相色譜法分析檢測海洋紅酵母Rhodotorula sp.的發(fā)酵次生代謝產(chǎn)物。取 1 mL 制備好的三種樣品分別使用 0.22 μm 的有機相濾膜至高效液相棕色瓶里，并使用分析型高效液相色譜儀進行測定。高效液相色譜的洗脫條件建立了兩個體系，，分別為甲酸乙腈體系和乙酸銨甲醇體系。對這兩個體系分別進行梯度濃度的調(diào)整，以確定最優(yōu)液相色譜洗脫條件，洗脫梯度如圖 2-1 所示。檢測波長265 nm，柱溫 35 ℃，安譜 C18 柱（25 mm ×4.6 mm, 5 μm），進樣量為 10 μL 。

表 2-1 甲酸乙腈體系洗脫方法Table 2-1 Method for eluting formic acid acetonitrile system時間（min） % 0.1%甲酸 %乙腈 流量（mL/min）0.0 99 1 115.0 99 1 160.0 55 45 1
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：O657.72;TQ920.1

【參考文獻】

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本文編號：2633907