【摘要】：焦化廢水中,難降解物喹啉及其衍生物是常見的含氮雜環(huán)污染物,因其有毒性、潛在致癌、致突變,因此研究喹啉降解十分必要。在過去四十年間,好氧條件下的喹啉降解研究報道較多,多株降解菌諸如Pseudomonas sp.,Rhodococcus sp.,Comamonas sp.等被分離出,4種降解通路anthranilate途徑和8-hydroxycoumarin途徑、5,6-dihydroxy-2(1H)quinolinone途徑、7,8-dihydroxy-2(1H)quinolino途徑被研究者們發(fā)現(xiàn)。然而,關(guān)于喹啉在無氧和缺氧下的降解研究較少且不夠深入。為探究厭氧/缺氧條件下的喹啉降解,實驗室建立了一個已穩(wěn)定運行多年的喹啉(唯一碳源)反硝化降解反應器。前期的工作表明,Thauera可能是該反應器中的功能優(yōu)勢菌,然而多次分離高豐度的Thauera菌株均未成功,分離出的3株Thauera能在除喹啉外的多種污染物為唯一的碳源生長(如吲哚、甲酚、二甲酚及苯酚等)。鑒于反硝化條件下喹啉關(guān)鍵菌和關(guān)鍵降解基因、代謝通路報道十分有限,我們改變思路,引入外界環(huán)境變量,試圖改變這個較穩(wěn)定的喹啉降解菌群,從而關(guān)聯(lián)分析群落結(jié)構(gòu)變化和功能變化以探究關(guān)鍵菌,并嘗試利用最新的比較轉(zhuǎn)錄組學技術(shù),探究厭氧喹啉降解基因和通路。本論文的第一部分,我們在批式培養(yǎng)中采用抗生素擾動反應器原始菌群,試圖簡化該較穩(wěn)定的反應器微生物群落結(jié)構(gòu),通過分析功能與結(jié)構(gòu)的變化,從而研究關(guān)鍵降解菌。實驗設置鏈霉素組和對照組(不加抗生素)。與對照組相比,鏈霉素處理后,喹啉降解率不降反升,上升7.9%,達66.6%;硝態(tài)氮去除率依然較高,超過80%。經(jīng)過對菌群16S rRNA基因V3-V4區(qū)的高通量測序,我們發(fā)現(xiàn)Thauera屬對鏈霉素不耐受(低于檢測限)。鏈霉素組在喹啉降解能力不降反升的情況下,得到的關(guān)鍵屬水平菌是Pseudomonas,Achromobacter,Bosea等,說明了這個反硝化喹啉降解群落的功能冗余,反應器中一些不占優(yōu)勢的菌可能在抗生素重塑的菌群后成為關(guān)鍵功能菌。本論文的第二部分,為探究厭氧喹啉降解的關(guān)鍵基因及推測出可能的通路,將一個穩(wěn)定運行多年的缺氧喹啉降解反應器生物膜(菌體)取出并在體外厭氧培養(yǎng)。分別設置2種底物即喹啉和2-羥基喹啉(大量文獻表明不論是厭氧或好氧條件,2-羥基喹啉是喹啉降解的第一個產(chǎn)物)作為體外批式培養(yǎng)的唯一碳源,動態(tài)取樣,結(jié)合菌體生長情況和喹啉/2-羥基喹啉去除情況取樣,提取mRNA,反轉(zhuǎn)錄、宏轉(zhuǎn)錄組測序,在RNA水平上分析。試圖通過同組不同時間、兩組不同碳源的對比找到基因表達差異,嘗試找到喹啉的降解相關(guān)基因。初步的分析結(jié)果表明,在添加喹啉后,很多基因受到誘導,如反硝化相關(guān)的基因、與芳香族化合物降解相關(guān)基因如�；o酶A脫氫酶(Acyl-CoA Dehydrogenase)基因以及抗氧化脅迫的氧化還原酶(Oxidoreductase)基因等表達量極顯著提高。尤其需要注意的是抗氧化脅迫的氧化還原酶基因在多種反硝化細菌中都極顯著地高表達,與無底物饑餓培養(yǎng)后的菌群相比較,該基因的表達高100倍以上。而喹啉誘導表達的基因的來源菌類型多樣,大多為反硝化細菌,如Thauera、Aeromonas、Ralstonia、Burkholderia、Pseudomonas、Sphingobium、Achromobacter等屬的細菌。高表達基因數(shù)最多的是Thauera屬細菌,有近60個來自Thauera細菌的基因的表達量高于饑餓菌群表達量的2倍以上。來自Thauera屬細菌的功能未知的基因Tmz1t_1458、Tmz1t_1262等在添加喹啉為碳源時表達量提高10-50倍,這些基因可能與喹啉的降解過程有關(guān)。綜上所述,本研究通過高通量測序,在DNA和RNA兩個水平上嘗試對反硝化喹啉降解菌群進行探究。通過環(huán)境基因組學分析,一方面證明在一個穩(wěn)定的降解菌群中,該反應器因特定抗生素造成的群落結(jié)構(gòu)的改變并不會造成其降解功能的劇變,且通過鏈霉素富集Pseudomonas(OTU1),Achromobacter(OTU2),Brevundimonas(OTU12),Bosea(OTU24)等關(guān)鍵OTU,推測這些關(guān)鍵菌可能在喹啉反硝化降解中發(fā)揮關(guān)鍵作用,同時是該群落功能冗余的證據(jù)。另一方面,通過環(huán)境轉(zhuǎn)錄組學分析,在代謝通路(KEGG,Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)等數(shù)據(jù)庫注釋后,喹啉組基因表達提高的基因主要是編碼脅迫蛋白的基因,包括編碼過氧化物酶的基因,且抗氧化脅迫的氧化還原酶基因在多種反硝化細菌中都顯著地高表達。同時發(fā)現(xiàn)喹啉組有55.78%的序列無法比對到KEGG數(shù)據(jù)庫中,這暗示著這些序列可能是新基因,且與喹啉反硝化降解相關(guān)。
【圖文】：

上海交通大學碩士學位論文第一章 緒論啉概述隨著工業(yè)廢水排放加重和人們對環(huán)保的重視，喹啉這種難降解污染物正日關(guān)注。世界各地的研究人員已在好氧條件下分離獲得一批可降解喹啉的細，并進行了一些降解機理與實際應用的研究，但關(guān)于缺氧/厭氧喹啉降解研缺乏[1-3]。 喹啉簡介喹啉（別名氮雜萘、苯并吡啶），是雜環(huán)芳香性有機物，是無色但有刺鼻氣吸濕性液體，分子式為 C9H7N，摩爾質(zhì)量是 129.16 g/mol，密度為 1.093 g/mL是 15℃，沸點為 238℃，分子結(jié)構(gòu)如圖 1-1。將喹啉暴露于光下，，會逐漸，并進一步變棕。喹啉微溶于水，但易溶于很多有機溶劑[4]。

圖 1-2 喹啉化合物污染的天然和人為來源[4]Fig.1-2 Natural and anthropogenic sources of quinoline compounds contamination[4]表1-1 焦化廢水中主要的有機污染物類別及含量[9]Table 1-1 Classification and percentage of organic compounds in coking wastewater[9]
【學位授予單位】：上海交通大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：X784;X172

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本文編號：2627832