【摘要】：隨著化石能源的日益枯竭和全球能源危機的加劇,可再生資源受到了廣泛的關(guān)注。木質(zhì)纖維素類材料作為地球上儲量最豐富的可再生生物質(zhì)資源之一,對其加以有效的利用可緩解全球能源危機。纖維素酶是一組能夠高效水解纖維素并生成可發(fā)酵糖的復(fù)合酶系的總稱,由于酶解反應(yīng)過程條件溫和,易于控制,對環(huán)境無污染等優(yōu)點己被廣泛地應(yīng)用于造紙、紡織、釀酒、食品、飼料、環(huán)保等多個行業(yè)。但是目前纖維素酶的開發(fā)應(yīng)用仍面臨著諸多問題,主要表現(xiàn)在纖維素酶生產(chǎn)菌株的生產(chǎn)性能不佳、酶的水解能力低下、下游分離工作繁瑣、生產(chǎn)成本高等問題,嚴重阻礙了纖維素酶行業(yè)的快速發(fā)展。所以,本論文主要采用了重離子束對綠色木霉孢子懸液進行輻照誘變以選育優(yōu)良的纖維素酶生產(chǎn)菌株,并進行了高活性纖維素酶突變株的纖維素酶發(fā)酵工藝優(yōu)化,同時應(yīng)用形態(tài)工程學(xué)技術(shù)對綠色木霉突變株的菌絲形態(tài)及相關(guān)代謝進行了初步研究,以探討發(fā)酵工藝和菌絲形態(tài)對纖維素酶活性的影響。主要研究結(jié)果如下:1、重離子束輻照誘變綠色木霉及高活性纖維素酶突變株的篩選利用不同劑量的重離子束輻照綠色木霉My的孢子懸液,綠色木霉的重離子束輻照效應(yīng)研究結(jié)果顯示,重離子束輻照綠色木霉的半致死劑量為120 Gy,輻照的劑量為400 Gy時,孢子的存活率降至9.43%,正突變率在40 Gy,160 Gy時高于負突變率,分別為18.52%,24%,在160Gy劑量下有助于高活性纖維素酶菌株的篩選。重離子束輻照后,通過平板水解圈法初篩、24孔深孔板復(fù)篩和搖瓶發(fā)酵復(fù)篩,最終在160 Gy的輻照劑量下篩選獲得一株高活性纖維素酶突變株My160-5,該菌株在液體搖瓶發(fā)酵120 h后,其濾紙酶活(FPA)和內(nèi)切葡聚糖酶活(EG)均高于原始菌株。My160-5的FPA和EG酶活達到了532.81 U/mL,875.15 U/mL,與出發(fā)菌株酶活相比分別提高了20.54%,24.4%(P0.01);對突變株My160-5進行斜面?zhèn)鞔囵B(yǎng)9代,結(jié)果表明菌株的遺傳穩(wěn)定性良好。2、綠色木霉高活性纖維素酶突變株My160-5的產(chǎn)酶發(fā)酵工藝優(yōu)化為了提高優(yōu)良生產(chǎn)菌株的纖維素酶活力,本部分實驗以誘變獲得的綠色木霉高活性纖維素酶突變株My160-5為研究對象,采用Plackett-Burman(PBD)實驗設(shè)計和響應(yīng)面分析法(RSM),對生產(chǎn)菌株的纖維素酶搖瓶發(fā)酵工藝進行優(yōu)化。結(jié)果顯示利用Plackett-Burman實驗設(shè)計從影響纖維素酶發(fā)酵的9個優(yōu)化參數(shù)中篩選出了初始pH值、CMC-Na和蛋白胨三個顯著影響因素,然后采用Box-Behnken(BBD)實驗設(shè)計和響應(yīng)面分析法進行后續(xù)優(yōu)化,最終優(yōu)化得到的纖維素酶最佳發(fā)酵條件為:CMC-Na 11.25 g/L,初始pH 4.25,蛋白胨6.5 g/L,裝液量為20%,(NH_4)_2SO_4 2.1g/L,KH_2PO_4 2g/L,Tween 80 1ml,發(fā)酵溫度30℃條件下發(fā)酵5天,在最優(yōu)的發(fā)酵條件下,經(jīng)過驗證實驗得到的最高濾紙酶活為628.36 U/m L,相比原始發(fā)酵水平提高了17.93%(P0.01)。3、綠色木霉高活性纖維素酶菌株液體發(fā)酵中的菌絲形態(tài)調(diào)控研究利用形態(tài)工程學(xué)技術(shù),借助微粒在流場中的作用來研究綠色木霉菌株My160-5的菌絲形態(tài)對纖維素酶活性及菌體生長的影響。結(jié)果顯示在添加了不同濃度的微粒后,綠色木霉菌株的菌絲形態(tài)發(fā)生顯著變化,隨著添加微粒濃度的增加菌球直徑顯著降低,在特定的菌球形態(tài)下FPA和EG酶活都顯著提高。添加濃度為10 g/L時,濾紙酶活和內(nèi)切葡聚糖酶活與對照相比分別提高了17.1%和13.3%。此外,根據(jù)菌球直徑隨著添加濃度的變化規(guī)律擬合了菌球直徑預(yù)測的數(shù)學(xué)函數(shù)模型,通過應(yīng)用形態(tài)工程學(xué)技術(shù)和數(shù)學(xué)建模手段來定向地控制綠色木霉的菌絲生長形態(tài)及發(fā)酵產(chǎn)酶活性,為纖維素酶的生產(chǎn)提供新的思路。
【圖文】：

圖 1.1 木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和組成[9]Figure 1.1 Structure and composition of lignocellulosic biomass木質(zhì)纖維素具有十分復(fù)雜的結(jié)構(gòu)組織，首先纖維素與半纖維素相互聯(lián)結(jié)，然后木質(zhì)素穿插其中形成復(fù)雜的三維網(wǎng)架結(jié)構(gòu)。如圖 1.1 所示，三者之間主要通過化學(xué)鍵、氫鍵和范德華力的相互作用使木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)緊密而不容易被水解利用。1.2.1.1 纖維素纖維素是由吡喃葡萄糖分子通過β-1,4-糖苷鍵連接形成纖維二糖分子[10]，再以纖維二糖為一個結(jié)構(gòu)單元構(gòu)成線性長鏈的纖維素大分子化合物（如圖 1.2 所示）[11]。(n-2)/2

半纖維素主要是由不同種類的糖構(gòu)成的短側(cè)鏈分支結(jié)構(gòu)，包括糖酸、戊糖（木糖等）、己糖（葡萄糖等）等單糖類[15]，其含量在植物細胞壁成分中僅次于纖維素。半纖維素的結(jié)構(gòu)組成在不同植物中存在著很大的差異，根據(jù)其分子結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成的差異可以分為甘露聚糖、木聚糖、木葡聚糖、以及混合糖苷鍵形成的葡聚糖等。通常在硬木本植物中，半纖維素主要以木聚糖的方式存在，而甘露聚糖則主要在草本植物中存在。半纖維素（無晶體結(jié)構(gòu)，排列松散，機械強度低等）與纖維素由于在結(jié)構(gòu)上的差異，前者更容易被水解利用[16]。此外，半纖維素與纖維素和木質(zhì)素相比，對熱化學(xué)處理的穩(wěn)定性差，在熱化學(xué)處理中，，其副官能團首先發(fā)生變構(gòu)而參與反應(yīng)，之后半纖維素骨架結(jié)構(gòu)才參與熱化學(xué)處理反應(yīng)[17]。1.2.1.3 木質(zhì)素木質(zhì)素是木質(zhì)纖維素中不能被水解利用的一類結(jié)構(gòu)組分，其主要由松柏醇、對香豆醇和芥子醇三種醇單體（如圖 1.3 所示）構(gòu)成，是一種在結(jié)構(gòu)上比較復(fù)雜
【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)院大學(xué)(中國科學(xué)院近代物理研究所)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：TQ925;Q93

【參考文獻】

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本文編號：2604616