MicroRNA(miRNA)在動植物體內(nèi)大量存在,并且參與調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育及脅迫應答等過程,但關于柑橘抗寒資源—枳(Poncirus trifoliata)低溫響應miRNA的研究目前還比較少。本論文在前期研究的基礎上,驗證了枳中鑒定出的一個低溫誘導新microRNA(即ptr-miR04)的抗寒功能,并初步解析了它的調(diào)控機制。主要結果如下:1.利用pre-miR04前體轉(zhuǎn)化的T2代轉(zhuǎn)基因煙草植株進行低溫處理,表型比較及生理指標(電導率、ROS等)分析表明轉(zhuǎn)基因植株的抗寒性弱于野生型,暗示ptrmiR04負調(diào)控植物抗寒性。2.在檸檬中超表達pre-miR04得到了轉(zhuǎn)基因陽性植株。低溫處理后,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因檸檬植株葉片萎蔫程度比野生型嚴重,而電導率、ROS的含量比野生型高,說明超表達ptr-miR04降低了植株抗寒性。利用STTM技術構建了ptr-miR04干涉載體并轉(zhuǎn)化枳,得到了陽性植株。3.生物信息學預測ptr-miR04的靶基因,發(fā)現(xiàn)其中一個靶基因為果糖-1,6-二磷酸醛縮酶(fructose-bisphosphate aldolase,FBA),低溫處理后對枳pre-miR04和FB...

【文章頁數(shù)】：62 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略詞表(Abbreviation)
1 前言
    1.1 課題的提出
    1.2 文獻綜述
        1.2.1 植物低溫脅迫研究進展
        1.2.2 柑橘低溫脅迫研究進展
        1.2.3 miRNA研究進展
            1.2.3.1 植物miRNA的生物合成
            1.2.3.2 植物miRNA的作用機制
            1.2.3.3 miRNA與植物逆境脅迫
            1.2.3.4 柑橘miRNA研究進展
        1.2.4 糖代謝與植物逆境應答
    1.3 本研究的目的與意義
2 實驗材料與方法
    2.1 材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 試劑
        2.1.3 載體及菌株
    2.2 方法
        2.2.1 材料培養(yǎng)與處理
        2.2.2 植物RNA提取及cDNA合成
        2.2.3 植物材料相關基因表達模式分析
        2.2.4 枳ptr-miR04靶基因預測
        2.2.5 載體構建
            2.2.5.1 構建短串聯(lián)靶標類似物STTM-miR04干涉載體
            2.2.5.2 構建瞬時表達載體
        2.2.6 大腸桿菌轉(zhuǎn)化及陽性鑒定
        2.2.7 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
        2.2.8 瞬時轉(zhuǎn)化驗證ptr-miR04與靶基因互作
        2.2.9 農(nóng)桿菌介導的柑橘遺傳轉(zhuǎn)化
            2.2.9.1 材料準備
            2.2.9.2 遺傳轉(zhuǎn)化
        2.2.10 轉(zhuǎn)基因植株陽性鑒定
            2.2.10.1 DNA提取
            2.2.10.2 PCR鑒定
        2.2.11 生理指標測定
            2.2.11.1 相對電導率測定
            2.2.11.2 DAB、NBT染色
            2.2.11.3 過氧化氫(H₂O₂)含量、抗超氧陰離子活力(anti-O2
-)、丙二醛(MDA)含量測定
            2.2.11.4 過氧化物酶(POD)活性、總超氧化物歧化酶(SOD)活性、過氧化氫酶(CAT)活性測定
            2.2.11.5 可溶性總糖、葡萄糖、果糖、蔗糖含量測定
        2.2.12 統(tǒng)計分析
3 結果與分析
    3.1 煙草T2代轉(zhuǎn)基因植株抗寒性驗證
        3.1.1 轉(zhuǎn)基因煙草PCR及表達量鑒定
        3.1.2 轉(zhuǎn)基因煙草低溫處理表型鑒定
        3.1.3 煙草抗寒生理指標測定
    3.2 轉(zhuǎn)基因檸檬抗寒性驗證
        3.2.1 pre-miR04超表達載體轉(zhuǎn)檸檬及植株陽性鑒定
        3.2.2 轉(zhuǎn)基因檸檬抗寒性分析
    3.3 ptr-miR04靶基因預測及驗證
        3.3.1 ptr-miR04靶基因預測
        3.3.2 枳基因表達量分析初步驗證ptr-miR04靶基因
        3.3.3 煙草瞬時表達驗證ptr-miR04及靶基因FBA的互作
        3.3.4 轉(zhuǎn)基因煙草中pre-miR04與靶基因表達量分析
    3.4 轉(zhuǎn)基因材料糖含量分析
        3.4.1 轉(zhuǎn)基因煙草糖含量分析
        3.4.2 轉(zhuǎn)基因檸檬糖含量分析
    3.5 STTM-miR04干涉載體構建及枳遺傳轉(zhuǎn)化
        3.5.1 STTM-mi R04干涉載體圖
        3.5.2 STTM-miR04干涉載體轉(zhuǎn)化枳及轉(zhuǎn)基因植株鑒定
4 討論
    4.1 ptr-miR04降低植株抗寒能力
    4.2 ptr-miR04可能通過FBA參與到糖代謝途徑
    4.3 miR04可能參與響應多種逆境脅迫
參考文獻
附錄
    Ⅰ 附表
    Ⅱ 附圖
致謝



本文編號：4032779

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