為研究甘露醇濃度、酶解時間、離心力大小和不同外植體對原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力的影響,采用正交試驗方案對甘藍原生質(zhì)體制備體系進行了優(yōu)化,并建立了甘藍原生質(zhì)體的瞬時轉(zhuǎn)化體系,同時利用該體系對甘藍CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)進行了初步研究。結(jié)果表明:以下胚軸為材料,酶液組成為1%纖維素酶+0.5%離析酶+0.6 mol/L甘露醇+10 mmol/L MES+1 mmol/L CaCl₂+0.1%BSA+5 mmol/Lβ-巰基乙醇,26℃,60 r/min,黑暗酶解6 h后,用2 115 r/min離心5 min收集細胞,可獲得高質(zhì)量的原生質(zhì)體,原生質(zhì)體產(chǎn)量約為3.0×10～6個/g,活力約為90.9%;另外,在20%PEG4000介導下,將帶有綠色熒光蛋白的載體（PYBA 1132）分別轉(zhuǎn)入從甘藍下胚軸、子葉、葉球分離獲得的原生質(zhì)體中,在熒光顯微鏡下觀察到GFP綠色熒光信號,轉(zhuǎn)化效率分別為43%,35%,19%,表明下胚軸分離獲得的原生質(zhì)體最適于瞬時轉(zhuǎn)化。同時以下胚軸分離獲得的原生質(zhì)體為受體,分別轉(zhuǎn)化線粒體特異表達載體COX和質(zhì)體特異表達載體969,也觀察到了熒光信號...

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圖1 甘露醇各水平的產(chǎn)量和活力均值LSD比較

進一步對各因素各水平間的處理結(jié)果進行LSD多重比較分析顯示,甘露醇作為滲透壓穩(wěn)定劑,過高或過低均會對原生質(zhì)體數(shù)量和活力產(chǎn)生影響,當甘露醇濃度達到0.6mol/L時,分離得到的原生質(zhì)體數(shù)量和活力均為最好,顯著高于其他2組(圖1);由圖2所示,隨著酶解時間的增加,分離得到的原生質(zhì)體....

圖2 酶解時間各水平的產(chǎn)量和活力均值LSD比較

圖1甘露醇各水平的產(chǎn)量和活力均值LSD比較2.2優(yōu)化條件下原生質(zhì)體制備

圖3 離心速度各水平的產(chǎn)量和活力均值LSD比較

通過四因素三水平的正交試驗設(shè)計,獲得了影響原生質(zhì)體制備的4個因素的最佳組合,因試驗設(shè)計中沒有最佳組合,故對試驗結(jié)果進行驗證,以甘藍下胚軸為外植體,在含有0.6mol/L甘露醇的酶解液中黑暗酶解6h,以2115r/min的離心速度收集細胞,對分離獲得的原生質(zhì)體數(shù)量和活力進行....

圖4 外植體各水平的產(chǎn)量和活力均值LSD比較

圖3離心速度各水平的產(chǎn)量和活力均值LSD比較圖5最佳條件下分離獲得的原生質(zhì)體形態(tài)和活力

本文編號：4022307