CRISPR/Cas9系統(tǒng)是近年來出現(xiàn)的一項新的生物技術(shù),能夠利用RNA介導(dǎo)基因編輯實現(xiàn)基因組的定向修飾,被逐漸應(yīng)用于多種植物的基因組編輯研究,但迄今尚未在柿屬植物中見到相關(guān)報道。柿果肉中原花青素的積累是其產(chǎn)生澀感的主要因素,原花青素的合成需要多種結(jié)構(gòu)基因和調(diào)控基因協(xié)同完成,其中結(jié)構(gòu)基因ANR通過將花青素轉(zhuǎn)變?yōu)樵ㄇ嗨厍绑w物質(zhì)—表兒茶素,發(fā)揮了關(guān)鍵作用;類胡蘿卜素是參與柿果及葉片等組織器官成色的重要色素,PDS基因在其生物合成過程中起關(guān)鍵作用,能夠催化無色的八氫番茄紅素轉(zhuǎn)換為有色的類胡蘿卜素。本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)分別對煙草Nt PDS基因和君遷子Dl ANR基因、Dl PDS基因進行定向敲除,首先通過已有報道構(gòu)建含有兩個靶點的雙元表達載體,進而利用遺傳轉(zhuǎn)化實現(xiàn)內(nèi)源基因的穩(wěn)定變異,最終通過表型觀察及測序檢測編輯效果;進一步將建立的技術(shù)體系應(yīng)用于柿屬植物。主要研究結(jié)果如下:1.選用植物的基因編輯載體PHSE401-GFP和PRGEB32-Gh6.7S-Cas9,針對栽培型煙草的Nt PDS基因構(gòu)建PHSE-2g R-Nt PDS、p RGEB-2g R-Nt PDS重組載體...

【文章頁數(shù)】：71 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略詞表
1 前言
    1.1 課題的提出
    1.2 君遷子DlANR和 DlPDS的研究進展
        1.2.1 概述
        1.2.2 DlANR參與的柿單寧生物合成途徑
        1.2.3 DlPDS參與的柿類胡蘿卜素合成途徑
    1.3 CRISPR/Cas系統(tǒng)的研究進展
        1.3.1 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)與作用機制
        1.3.2 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的改造升級
        1.3.3 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的應(yīng)用
        1.3.4 其他CRISPR系統(tǒng)概述
    1.4 研究意義和內(nèi)容
2 材料與方法
    2.1 試驗材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 菌株與載體
    2.2 試驗方法
        2.2.1 DlPDS和 DlANR基因的鑒定及靶序列擴增
        2.2.2 敲除靶點設(shè)計
        2.2.3 sgRNA克隆框的擴增
            2.2.3.1 pCBC-2g RNA表達框的擴增
            2.2.3.2 pGTR4-2g RNA表達框的擴增
        2.2.4 雙靶點CRISPR載體的構(gòu)建
            2.2.4.1 pHSE-GFP-2g R敲除載體的構(gòu)建
            2.2.4.2 pRGEB32-2g R敲除載體的構(gòu)建
        2.2.5 重組載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
        2.2.6 葉盤法轉(zhuǎn)化煙草及君遷子
        2.2.7 再生苗DNA的提取及陽性鑒定
        2.2.8 DNA靶向片段的克隆與檢測
3 結(jié)果與分析
    3.1 靶基因DlPDS和 DlANR的序列分析
    3.2 靶點的選定及引物設(shè)計結(jié)果
    3.3 CRISPR表達載體的構(gòu)建分析
    3.4 煙草及君遷子穩(wěn)定遺傳株系的獲得
    3.5 煙草轉(zhuǎn)基因株系的編輯檢測
    3.6 君遷子再生植株的基因敲除鑒定
4 討論
    4.1 君遷子敲除基因DlPDS和 DlANR的功能及序列分析
    4.2 不同CRISPR/Cas9 載體轉(zhuǎn)化煙草及君遷子的編輯效率分析
    4.3 遺傳轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化
    4.4 問題與展望
參考文獻
附錄
簡歷及在學(xué)期間科研實踐
致謝



本文編號：3780848