啟動子對研究基因功能和植物生長發(fā)育的調控具有重要價值。組成型表達的啟動子,如CaMV35S啟動子,因其能促進外源基因在轉基因植物中的表達,現(xiàn)被廣泛應用于植物基因功能研究。雖然它可以驅動外源基因在宿主中高度表達,但由于其組成型表達的特點,它也會在宿主植物整個生長發(fā)育過程中的各個時期和各個組織中高度表達,從而過量表達目的基因,對植物的生長發(fā)育造成阻礙。組織特異性表達啟動子和誘導型啟動子可以克服這些缺點,它們可以在特定組織或特殊誘導條件下表達,植物外源基因的表達可被精確地控制,避免了目標基因過量表達對于植物造成的不良影響。百合在觀賞方面具有重要的價值,但它易受不良環(huán)境（如低溫,干旱,病害等）的影響。因此研究百合抗寒相關基因甘油-3-磷酸�；D移酶（GPAT）基因的啟動子對百合及其它植物的抗逆分子育種具有重要的價值。本研究以抗寒品種岷江百合為實驗材料,應用染色體步移的技術,對岷江百合GPAT基因啟動子進行克隆,并對其功能進行了初步研究。主要的實驗結果如下：1.根據(jù)岷江百合GPAT基因編碼區(qū)序列設計引物,以岷江百合基因組DNA為模板,利用染色體步移技術,用了接頭PCR和FPNI-PCR的兩種方法... 

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【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
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第一章 文獻綜述
    1.1 植物抗寒基因GPAT
        1.1.1 GPAT基因應答機制
        1.1.2 GPAT基因研究進展
    1.2 植物啟動子
        1.2.1 啟動子概述
            1.2.1.1 啟動子基本特征
        1.2.2 啟動子類型
            1.2.2.1 組成型啟動子
            1.2.2.2 組織特異性啟動子
            1.2.2.3 誘導型啟動子
        1.2.3 啟動子克隆方法
        1.2.4 啟動子功能研究方法
    1.3 百合抗寒的研究進展
    1.4 本試驗的目的及意義
    1.5 研究技術路線
第二章 岷江百合GPAT基因啟動子的克隆及結構預測
    2.1 實驗材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 菌株與克隆載體
        2.1.3 實驗試劑
        2.1.4 實驗儀器及常用生物學軟件
        2.1.5 培養(yǎng)基及常用試劑的配置方法
    2.2 實驗方法
        2.2.1 民江百合的組培
        2.2.2 民江百合基因組DNA的提取
        2.2.3 染色體步移法擴增GPAT基因啟動子序列
            2.2.3.1 接頭PCR法克隆啟動子序列
            2.2.3.2 FPNI-PCR法克隆啟動子序列
        2.2.4 GPAT基因5'調控序列的測定
            2.2.4.1 PCR產物的回收
            2.2.4.2 回收的目的DNA片段與pGM-T的連接
            2.2.4.3 連接產物的的轉化和藍白斑篩選
            2.2.4.4 陽性克隆的PCR鑒定及測序
    2.3 結果與分析
        2.3.1 岷江百合的組培
        2.3.2 岷江百合基因組DNA的提取
        2.3.3 染色體步移法擴增GPAT基因啟動子序列
            2.3.3.1 第一次接頭PCR擴增
            2.3.3.2 第二次接頭PCR法擴增
            2.3.3.3 第一次FPNI-PCR法擴增
            2.3.3.4 第二次FPNI-PCR擴增
        2.3.4 接頭PCR與FPNI-PCR擴增啟動子比較
        2.3.5 GPAT基因啟動子的結構分析
    2.4 討論
第三章 岷江百合GPAT基因啟動子缺失表達載體的構建
    3.1 實驗材料
        3.1.1 菌株與質粒
        3.1.2 實驗試劑
        3.1.3 主要儀器及生物軟件
    3.2 實驗方法
        3.2.1 GPAT基因啟動子5’端缺失片段的克隆
        3.2.2 重組表達載體的構建
            3.2.2.1 GPAT啟動子缺失片段中間載體的構建
            3.2.2.2 GPAT啟動子缺失體和pCAMBIA 1304的質粒提取
            3.2.2.3 GPAT啟動子缺失體質粒和載體pCAMBIA 1304質粒的酶切處理
            3.2.2.4 重組表達載體質粒的構建
    3.3 結果與分析
        3.3.1 GPAT基因啟動子5’端缺失體的克隆
        3.3.2 缺失體重組質粒和pCAMBIA1304植物表達載體的雙酶切
        3.3.3 GFP/GUS融合表達載體的構建及檢測
    3.4 討論
第四章 GPAT基因啟動子的瞬時表達分析及煙草轉化植株的獲得和鑒定
    4.1 實驗材料
        4.1.1 植物材料
        4.1.2 菌株與表達載體
        4.1.3 實驗試劑
        4.1.4 主要儀器及常用生物軟件
    4.2 實驗方法
        4.2.1 煙草組培苗的培養(yǎng)
        4.2.2 農桿菌介導轉化煙草
            4.2.2.1 農桿菌感受態(tài)細胞的制備和農桿菌的轉化
            4.2.2.2 重組農桿菌的鑒定
        4.2.3 組織化學染色
    4.3 結果與分析
        4.3.1 植物表達載體pCAMBIA1304-GPATp導入農桿菌的驗證
        4.3.2 GUS報告基因瞬時表達檢測啟動子的活性
    4.4 煙草轉化植株的獲得
        4.4.1 煙草的轉化
        4.4.2 煙草轉化植株的檢測
            4.4.2.1 煙草轉化植株的DNA提取
            4.4.2.2 PCR檢測
        4.4.3 結果與分析
            4.4.3.1 煙草的轉化
            4.4.3.2 PCR驗證煙草轉化植株
    4.5 討論
第五章 結論
參考文獻
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
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碩士論文
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本文編號：3689083