西瓜（Citrulluslanatus）是我國重要的經(jīng)濟作物和水果,富含各種營養(yǎng)成分。瓜氨酸作為西瓜的營養(yǎng)成分之一,是一種有效的氧自由基清除劑,在西瓜抗逆性代謝中發(fā)揮重要作用。而在人體中,瓜氨酸是參與尿素循環(huán)的中間代謝產(chǎn)物,有調(diào)節(jié)人體機能的作用。鳥氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶（OCT）不僅是瓜氨酸合成代謝的關(guān)鍵酶,通過催化鳥氨酸和氨甲醜磷酸反應(yīng)合成瓜氨酸和磷酸鹽,而且參與了高等植物嘧啶與多胺的形成。對西瓜OCT的分離純化有助于對該酶在西瓜瓜氨酸合成代謝及抗逆調(diào)控中作用的研究,從而為改良西瓜品種及選育新品種提供參考依據(jù);而對西瓜OCT基因的克隆、表達及純化,為研究OCT基因的功能及催化反應(yīng)機理等研究奠定基礎(chǔ)。本研究對西瓜OCT的提取條件進行了優(yōu)化,利用熱處理、鹽析及透析法對西瓜OCT進行分離純化,并對OCT的一些酶學(xué)特性進行了研究。同時利用分子生物學(xué)方法克隆并分析了西瓜OCT基因,構(gòu)建了重組OCT蛋白原核表達載體,對其進行了表達、純化、復(fù)性及活性分析。結(jié)果如下:1、西瓜OCT提取的最佳條件:Tris-HCl緩沖液pH值為8.5、料液比為1:5及提取時間為4 h;利用熱處理、鹽析及透析純化所得該酶的純... 

【文章頁數(shù)】：60 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 引言
    1.1 西瓜的研究現(xiàn)狀
        1.1.1 西瓜的起源與分布
        1.1.2 西瓜的營養(yǎng)與價值
        1.1.3 西瓜的種植現(xiàn)狀
    1.2 西瓜瓜氨酸的研究現(xiàn)狀
    1.3 西瓜瓜氨酸合成中鳥氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶的研究現(xiàn)狀
        1.3.1 鳥氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶的分離提純研究
        1.3.2 鳥氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶的酶促反應(yīng)動力學(xué)研究
        1.3.3 鳥氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶的基因結(jié)構(gòu)研究
        1.3.4 鳥氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶的分布定位研究
    1.4 技術(shù)路線
    1.5 目的與意義
2 材料與方法
    2.1 材料
        2.1.1 試驗材料
        2.1.2 酶與試劑盒
        2.1.3 化學(xué)試劑與儀器設(shè)備
        2.1.4 PCR引物設(shè)計
        2.1.5 常用試劑配制
    2.2 方法
        2.2.1 西瓜OCT的提取及條件優(yōu)化
        2.2.2 西瓜OCT的分離純化
        2.2.3 西瓜OCT的酶學(xué)特性
        2.2.4 西瓜葉片總RNA的提取
        2.2.5 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA
        2.2.6 PCR擴增
        2.2.7 PCR產(chǎn)物純化
        2.2.8 重組克隆載體的構(gòu)建
        2.2.9 生物信息學(xué)分析
        2.2.10 重組pMD18-T-OCT質(zhì)粒DNA的提取
        2.2.11 開放閱讀框的克隆
        2.2.12 原核表達載體構(gòu)建及鑒定
        2.2.13 工程菌的表達
        2.2.14 重組pET-30a-OCT蛋白誘導(dǎo)表達條件的優(yōu)化
        2.2.15 重組pET-30a-OCT包涵體蛋白的純化及復(fù)性
        2.2.16 重組pET-30a-OCT蛋白的質(zhì)譜鑒定
3 結(jié)果與分析
    3.1 西瓜OCT的提取及條件優(yōu)化
        3.1.1 不同緩沖液pH值對OCT活力的影響
        3.1.2 不同料液比對OCT活力的影響
        3.1.3 不同提取時間對OCT活力的影響
        3.1.4 西瓜OCT提取條件的優(yōu)化
    3.2 西瓜OCT的分離純化
        3.2.1 蛋白標準曲線
        3.2.2 熱處理
        3.2.3 鹽析
        3.2.4 透析
        3.2.5 西瓜OCT的分離純化
    3.3 西瓜OCT的酶學(xué)特性
        3.3.1 酶促反應(yīng)的最適溫度
        3.3.2 酶促反應(yīng)的最造pH值
        3.3.3 酶促反應(yīng)的K_m與V_(max)值的測定
        3.3.4 金屬離子及抑制劑對酶活力的影響
        3.3.5 西瓜總RNA的提取
        3.3.6 PCR擴增
        3.3.7 生物信息學(xué)分析
        3.3.8 重組表達載體pET-30a-OCT的雙酶切鑒定
        3.3.9 重組pET30a-OCT的誘導(dǎo)表達
        3.3.10 重組pET-30a-OCT誘導(dǎo)表達條件的優(yōu)化
        3.3.11 重組pET-30a-OCT包涵體蛋白的純化及復(fù)性
        3.3.12 重組pET-30a-OCT的質(zhì)譜鑒定
4 討論
    4.1 西瓜OCT的提取及條件優(yōu)化
    4.2 西瓜OCT的分離純化
    4.3 西瓜OCT的酶學(xué)特性
    4.4 西瓜OCT蛋白的基因克隆與生物信息學(xué)分析
    4.5 重組pET-30a-OCT的誘導(dǎo)表達
    4.6 重組pET-30a-OCT誘導(dǎo)表達條件的優(yōu)化
    4.7 重組pET-30a-OCT包涵體蛋白的純化及復(fù)性
    4.8 重組pET-30a-OCT蛋白的質(zhì)譜鑒定
5 結(jié)論與展望
    5.1 結(jié)論
    5.2 展望
參考文獻
附錄
致謝



本文編號：3647163