由尖孢鐮刀菌古巴專化型引起的香蕉枯萎病是一種具有毀滅性的土傳維管束病害,目前還沒有一種防治效果理想的化學藥劑,且化學防治存在田間藥劑流失嚴重、危害環(huán)境和人類的健康等問題。因此,培育抗病品種成為十分迫切的替代策略。探討尖孢鐮刀菌的致病相關(guān)基因的功能,可以深入了解尖孢鐮刀菌的致病機理,有利于抗病育種研究。前期蛋白質(zhì)組學研究發(fā)現(xiàn)尖孢鐮刀菌古巴�；�4號小種（Foc4）中的過氧化氫酶1 （cat1）基因和細胞色素c過氧化物酶（CcP）基因受到巴西蕉誘導上調(diào)表達,為研究cat1和CcP基因在Foc4侵染香蕉過程中的作用,利用同源重組方法分別敲除Foc4的cat1和CcP基因,并對敲除子進行了回復(fù),而后對敲除子/回復(fù)子進行了表型分析和致病性測定。結(jié)果如下:1.成功擴增Foc4的cat1基因和CcP基因左右側(cè)同源臂,并構(gòu)建了帶GFP （綠色熒光蛋白）標記的敲除載體。2.利用PEG介導的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法,對Foc4菌株進行了基因敲除,獲得帶有綠色熒光蛋白和潮霉素B雙標記的cat1基因缺失突變體和CcP基因缺失突變體。通過融合PCR方法構(gòu)建對應(yīng)的轉(zhuǎn)化片段,轉(zhuǎn)化敲除子,得到帶有G418抗性的cat1基因回復(fù)... 

【文章來源】：海南大學海南省211工程院校

【文章頁數(shù)】：72 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1. 導論
    1.1 尖孢鐮刀菌
        1.1.1 尖孢鐮刀菌簡介
        1.1.2 尖孢鐮刀菌致病機理
    1.2 香蕉枯萎病
        1.2.1 香蕉枯萎病的發(fā)生與危害
        1.2.2 香蕉枯萎病的發(fā)病癥狀
        1.2.3 香蕉枯萎病的防治
    1.3 植物病原真菌中的氧化應(yīng)激反應(yīng)
        1.3.1 氧化應(yīng)激反應(yīng)
        1.3.2 過氧化氫酶
        1.3.3 細胞色素c過氧化物酶
    1.4 融合PCR法構(gòu)建同源重組DNA片段
    1.5 本研究的目的及意義
2. 材料與方法
    2.1 材料
        2.1.1 菌株與質(zhì)粒
        2.1.2 試劑及配方
        2.1.3 培養(yǎng)基及配方
        2.1.4 儀器
    2.2 實驗方法
        2.2.1 cat1和CcP全長基因的克隆
        2.2.2 cat1和CcP基因克隆載體的構(gòu)建
        2.2.3 cat1和CcP基因敲除載體的構(gòu)建
        2.2.4 尖孢鐮刀菌PEG轉(zhuǎn)化
        2.2.5 基因敲除轉(zhuǎn)化子的鑒定
        2.2.6 突變體菌株表型觀察
        2.2.7 致病性測定
        2.2.8 數(shù)據(jù)處理
        2.2.9 cat1和CcP基因功能回復(fù)驗證
3. 結(jié)果與分析
    3.1 全長基因的克隆
    3.2 克隆載體的構(gòu)建
        3.2.1 同源臂的擴增
        3.2.2 克隆載體的酶切鑒定
    3.3 基因敲除載體的構(gòu)建
        3.3.1 cat1-A-pCT74和CcP-B-pCT74載體酶切鑒定
        3.3.2 B-cat1-A-pCT74和A-CcP-B-pCT74載體酶切鑒定
        3.3.3 敲除轉(zhuǎn)化片段的PCR擴增
    3.4 原生質(zhì)體的制備
    3.5 敲除轉(zhuǎn)化子的鑒定
        3.5.1 轉(zhuǎn)化子的綠色熒光檢測
        3.5.2 轉(zhuǎn)化子的PCR驗證
    3.6 回復(fù)轉(zhuǎn)化片段的構(gòu)建
        3.6.1 三個片段的PCR擴增
        3.6.2 回復(fù)片段的PCR擴增
    3.7 回復(fù)轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定
    3.8 敲除子/回復(fù)子的表型分析
        3.8.1 菌落形態(tài)觀察
        3.8.2 玻璃紙穿透實驗
        3.8.3 纖維素利用實驗
        3.8.4 過氧化氫耐受性實驗
        3.8.5 滲透壓脅迫實驗
        3.8.6 細胞壁選擇性壓力實驗
    3.9 敲除子/回復(fù)子的致病力測定
        3.9.1 香蕉離體葉片實驗
        3.9.2 香蕉盆栽苗致病力測定
        3.9.3 病情指數(shù)和發(fā)病率統(tǒng)計
4. 討論
    4.1 敲除和互補載體的構(gòu)建
    4.2 PEG介導的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化
    4.3 轉(zhuǎn)化子的檢測鑒定
    4.4 敲除突變體的表型分析
    4.5 敲除突變體致病力的測定
    4.6 回復(fù)子功能驗證
5. 結(jié)論
參考文獻
附錄
基金項目
論文發(fā)表情況
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
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[3]幾株尖孢鐮刀菌的綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)化[J]. 黃東杰,彭明,李春強.  熱帶農(nóng)業(yè)科學. 2014(01)
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博士論文
[1]幾個抗氧化脅迫相關(guān)基因在香蕉枯萎病菌致病中的作用研究[D]. 齊興柱.海南大學 2013

碩士論文
[1]絲狀真菌遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的建立[D]. 周慶新.山東農(nóng)業(yè)大學 2007



本文編號：3637825