典型的漆酶通常屬于輔助活性酶第一家族第一亞族（auxiliary activity family 1 subfamily 1,簡(jiǎn)稱AA1₁家族）,而AA1₂家族的多銅氧化酶通常擁有將二價(jià)鐵氧化成三價(jià)鐵的活性,部分AA1₂家族酶蛋白兼具漆酶活性。梯棱羊肚菌全基因組只有一個(gè)AA1₂家族酶基因,該基因編碼的酶蛋白是否擁有漆酶功能尚未清楚。本研究主要從酶生化特性的角度,結(jié)合酶基因的表達(dá)規(guī)律,對(duì)該基因的功能進(jìn)行初探。對(duì)該AA1₂家族基因在梯棱羊肚菌生長(zhǎng)發(fā)育不同階段的表達(dá)水平進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè);將該基因編碼序列克隆到表達(dá)載體中在大腸桿菌中異源表達(dá),層析獲得純化的酶蛋白,對(duì)酶蛋白的生化特性進(jìn)行了鑒定。發(fā)現(xiàn)該AA1₂多銅氧化酶基因在外源營(yíng)養(yǎng)袋和土壤中的營(yíng)養(yǎng)菌絲里低表達(dá),在菇原基和子實(shí)體中表達(dá)較活躍。異源表達(dá)獲得純化的酶蛋白分子量約64k Da,表現(xiàn)出亞鐵氧化酶（EC1.16.3.1）與漆酶（EC1.10.3.2）雙重活性。其亞鐵氧化酶活性在pH4最高,漆酶活性在pH6... 

【文章來(lái)源】：菌物學(xué)報(bào). 2020,39(06)北大核心CSCD

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【部分圖文】：

MiFOX基因與其他已知屬于AA1＿2家族的酶基因氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)

利用熒光實(shí)時(shí)定量PCR方法對(duì)MiFOX在梯棱羊肚菌不同生長(zhǎng)階段的表達(dá)量進(jìn)行相對(duì)定量和對(duì)比。結(jié)果顯示，MiFOX基因在放置營(yíng)養(yǎng)袋之前、放置營(yíng)養(yǎng)袋之后和臨近菇原基形成前的土壤菌絲中，以及營(yíng)養(yǎng)袋菌絲中的相對(duì)表達(dá)量都較低，在菇原基和子實(shí)體中的相對(duì)表達(dá)量較高。在子實(shí)體階段，菌柄與菌蓋中的相對(duì)表達(dá)量接近。說(shuō)明MiFOX可能在子實(shí)體形成和生長(zhǎng)發(fā)育階段起主要作用，而在攝取土壤和營(yíng)養(yǎng)袋中養(yǎng)分的階段的作用相對(duì)較�。▓D3）。2.3 大腸桿菌異源表達(dá)MiFOX酶蛋白的活性鑒定

MiFOX基因長(zhǎng)度2 011bp，共有5個(gè)外顯子、4個(gè)內(nèi)含子（圖1A）。由于MiFOX基因所屬的梯棱羊肚菌SCYDJ1-A1菌株全基因組進(jìn)行基因注釋時(shí)是利用對(duì)應(yīng)的cDNA標(biāo)定外顯子區(qū)域，因此外顯子和內(nèi)含子的起止位置是真實(shí)的。編碼的蛋白序列長(zhǎng)575個(gè)氨基酸，N端帶有18個(gè)氨基酸的信號(hào)肽，該基因編碼的蛋白可能是分泌型蛋白。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)其分子量為63.6kDa，等電點(diǎn)為4.67。3D結(jié)構(gòu)模型預(yù)測(cè)軟件I-TASSER為MiFOX酶蛋白尋找到的最高相似度模板是啤酒酵母的AA1＿2家族多銅氧化酶Fet3p(PDB登錄號(hào)1ZPU），有90%的區(qū)段比對(duì)上，比對(duì)上的區(qū)域中氨基酸序列相似度49%。預(yù)測(cè)的3D結(jié)構(gòu)模型為不規(guī)則筒狀，大體上呈三輻射形，有3對(duì)β-片層構(gòu)成三葉螺旋槳形（圖1B）。每對(duì)β-片層構(gòu)成一個(gè)槳葉，相互貼近略呈平行夾板狀。在3對(duì)β-片層中，中段和C端的兩對(duì)β-片層較為典型，而N端的一對(duì)β-片層較不規(guī)整。3對(duì)β-片層之間由多個(gè)α-螺旋和不規(guī)則卷曲串起來(lái)。將MiFOX基因與其他已知的屬于AA1＿2家族的酶基因進(jìn)行氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育分析（圖2）。CAZy主頁(yè)上至2020年2月15日為止已公布的389個(gè)被分類(lèi)為AA1＿2家族的酶基因（http://www.cazy.org/AA1＿2＿all.html），均屬于真核生物。剔除重復(fù)和無(wú)效序列后，得到382個(gè)有效的AA1＿2家族酶基因序列，加上梯棱羊肚菌另一菌株CCBAS932中的1個(gè)AA1＿2家族同源基因（GenBank登錄號(hào)RPB13240），共384個(gè)AA1＿2家族的酶基因，將氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)后，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)（圖2）。梯棱羊肚菌SCYDJ1-A1菌株中的MiFOX（圖2黑色箭頭示）與CCBAS932菌株中的對(duì)應(yīng)同源基因（圖2空心箭頭示）氨基酸序列和長(zhǎng)度都完全相同，與其他絲狀真菌如各種曲霉、鐮刀菌等的AA1＿2家族酶基因在系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系上相對(duì)較近，與大多數(shù)酵母中的AA1＿2家族酶基因在系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系上相對(duì)較遠(yuǎn)�？傮w而言，同一個(gè)物種不同菌株的AA1＿2家族基因在氨基酸序列上高度相似或完全相同，僅在不同物種之間表現(xiàn)出相對(duì)較大的差異，說(shuō)明AA1＿2酶基因是一個(gè)進(jìn)化上較為保守的基因。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]四川羊肚菌人工栽培的現(xiàn)狀分析[J]. 彭衛(wèi)紅,唐杰,何曉蘭,陳影,譚昊.  食藥用菌. 2016(03)
[2]草菇漆酶基因在子實(shí)體形成過(guò)程中的表達(dá)分析[J]. 茅文俊,李燕,周陳力,王瑩,朱剛,鮑大鵬,汪瀅.  食用菌學(xué)報(bào). 2016(01)
[3]食(藥)用真菌比較基因組分析揭示其生態(tài)特性[J]. 吳冰,章小靈,崔寶凱,戴玉成.  菌物學(xué)報(bào). 2015(04)
[4]糙皮側(cè)耳生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中漆酶基因家族的表達(dá)研究[J]. 卓睿,馬富英,周帥,張曉昱.  菌物學(xué)報(bào). 2015(04)
[5]與金針菇子實(shí)體發(fā)育有關(guān)的漆酶編碼基因Fv-lac4的結(jié)構(gòu)及表達(dá)差異分析[J]. 吳光美,嚴(yán)俊杰,楊志云,張婷鵑,謝寶貴.  基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué). 2014(06)
[6]真菌漆酶性質(zhì)、分子生物學(xué)及其應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 司靜,李偉,崔寶凱,戴玉成.  生物技術(shù)通報(bào). 2011(02)

博士論文
[1]漆酶在斑玉蕈菌絲生長(zhǎng)和子實(shí)體發(fā)育中的功能研究[D]. 張津京.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 2014



本文編號(hào)：3623694