柑橘番茄紅素β-環(huán)化酶基因功能分析及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究
發(fā)布時(shí)間：2021-04-29 22:07
類胡蘿卜素是一類對(duì)植物和人體健康非常重要的次生代謝物。盡管類胡蘿卜素代謝研究已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展,但是關(guān)于類胡蘿卜素代謝調(diào)控的分子機(jī)理還不夠清晰。柑橘果實(shí)含有豐富的類胡蘿卜素,并且類胡蘿卜素含量和組成決定了果實(shí)外觀品質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)效益。因此,研究柑橘類胡蘿卜素代謝具有重要的理論和實(shí)踐意義。番茄紅素β-環(huán)化酶（LCYb）是位于類胡蘿卜素合成途徑分支點(diǎn)的關(guān)鍵酶。大量研究表明,LCYb基因表達(dá)水平與類胡蘿卜素含量和組成密切相關(guān)。但是,關(guān)于LCYb基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制還未知,在柑橘乃至整個(gè)植物界中還沒有轉(zhuǎn)錄因子被證明能直接調(diào)控其表達(dá)。因此,本研究以柑橘LCYb基因?yàn)榍腥朦c(diǎn),深入分析該基因表達(dá)模式、序列多態(tài)性以及酶活性特點(diǎn);并克隆和鑒定該基因啟動(dòng)子序列、表達(dá)活性及其關(guān)鍵順式作用元件;進(jìn)一步利用酵母單雜交系統(tǒng),篩選可能與LCYb啟動(dòng)子互作的轉(zhuǎn)錄因子;采用遺傳學(xué)、分子生物學(xué)和生物化學(xué)等方法,驗(yàn)證候選轉(zhuǎn)錄因子參與類胡蘿卜素代謝的轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能。主要研究結(jié)果如下:1.LCYb基因功能分析。大多數(shù)柑橘品種含有2種類型的LCYb基因,并且每種類型又含有2個(gè)不同的等位基因（LCYb1a、LCYb1b、LC...
【文章來(lái)源】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)湖北省 211工程院校 教育部直屬院校
【文章頁(yè)數(shù)】：193 頁(yè)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略詞表
第一章 前言
1 課題的提出
2 植物類胡蘿卜素代謝研究進(jìn)展
2.1 類胡蘿卜素簡(jiǎn)介
2.2 植物類胡蘿卜素代謝
2.2.1 植物類胡蘿卜素代謝途徑
2.2.2 植物類胡蘿卜素代謝途徑上主要結(jié)構(gòu)基因
2.2.3 影響植物類胡蘿卜素代謝的因素
2.3 植物類胡蘿卜素代謝的分子調(diào)控
2.3.1 轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控
2.3.2 其他分子水平調(diào)控
2.4 柑橘類胡蘿卜素代謝研究進(jìn)展
2.4.1 柑橘類胡蘿卜素代謝
2.4.2 柑橘類胡蘿卜素代謝與番茄紅素β-環(huán)化酶基因
3 本研究的目的和內(nèi)容
第二章 柑橘LCYb基因功能分析
1 引言
2 材料和方法
2.1 實(shí)驗(yàn)材料
2.2 實(shí)驗(yàn)方法
2.2.1 DNA提取、RNA提取及cDNA合成
2.2.2 基因克隆及序列分析
2.2.3 實(shí)時(shí)定量PCR
2.2.4 原核表達(dá)載體構(gòu)建及工程菌實(shí)驗(yàn)
2.2.5 細(xì)菌類胡蘿卜素提取及測(cè)定
2.2.6 點(diǎn)突變
3 結(jié)果與分析
3.1 甜橙LCYb基因表達(dá)分析
3.2 不同柑橘品種LCYb2基因序列的等位多態(tài)性分析
3.3 不同柑橘品種LCYb2環(huán)化酶活性分析
3.4 甜橙2個(gè)LCYb2等位基因的點(diǎn)突變分析
4 討論
4.1 柑橘中LCYb2基因的重要作用
4.2 柑橘LCYb2基因的等位多態(tài)性與不同柑橘品種的進(jìn)化關(guān)系有關(guān)
4.3 72 位和359位氨基酸是影響LCYb2酶活性的關(guān)鍵位點(diǎn)
第三章 柑橘LCYb啟動(dòng)子的克隆和活性分析
1 引言
2 材料與方法
2.1 實(shí)驗(yàn)材料
2.2 實(shí)驗(yàn)方法
2.2.1 DNA提取
2.2.2 啟動(dòng)子克隆
2.2.3 啟動(dòng)子序列生物信息學(xué)分析
2.2.4 啟動(dòng)子表達(dá)載體構(gòu)建
2.2.5 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的番茄果實(shí)瞬時(shí)轉(zhuǎn)化
2.2.6 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的擬南芥穩(wěn)定轉(zhuǎn)化
2.2.7 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的柑橘愈傷組織穩(wěn)定轉(zhuǎn)化
2.2.8 外源因子處理
2.2.9 GUS定性定量檢測(cè)
2.2.10 簡(jiǎn)單序列重復(fù)(SSR)標(biāo)記
2.2.11 數(shù)據(jù)分析
3 結(jié)果與分析
3.1 甜橙CsLCYb1啟動(dòng)子序列分析
3.2 瞬時(shí)表達(dá)番茄果實(shí)中CsLCYb1啟動(dòng)子活性分析
3.3 穩(wěn)定轉(zhuǎn)化擬南芥植株中CsLCYb1啟動(dòng)子活性分析
3.3.1 CsLCYb1不同啟動(dòng)子缺失片段的組織特異性活性分析
3.3.2 CsLCYb1全長(zhǎng)啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)基因擬南芥不同發(fā)育時(shí)期的活性分析
3.3.3 CsLCYb1不同啟動(dòng)子缺失片段在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的活性比較
3.4 穩(wěn)定轉(zhuǎn)化柑橘愈傷組織中CsLCYb1啟動(dòng)子活性分析
3.4.1 CsLCYb1不同啟動(dòng)子缺失片段在轉(zhuǎn)基因愈傷中的活性比較
3.4.2 CsLCYb1不同啟動(dòng)子缺失片段響應(yīng)外源因子處理的活性變化
3.5 CsLCYb1啟動(dòng)子精細(xì)缺失分析
3.6 其他柑橘品種LCYb1啟動(dòng)子序列分析
3.7 甜橙CsLCYb2啟動(dòng)子序列分析
3.8 瞬時(shí)表達(dá)番茄果實(shí)中CsLCYb2啟動(dòng)子活性分析
4 討論
4.1 CsLCYb1不同啟動(dòng)子缺失片段表達(dá)特點(diǎn)
4.2 CsLCYb1啟動(dòng)子響應(yīng)不同外源和內(nèi)源因子的表達(dá)特點(diǎn)
4.3 一個(gè)新的增強(qiáng)子元件與CsLCYb1啟動(dòng)子活性密切相關(guān)
4.4 不同柑橘品種LCYb1啟動(dòng)子上增強(qiáng)子元件拷貝數(shù)差異
4.5 CsLCYb2啟動(dòng)子分析為等位基因差異表達(dá)的分子機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)
第四章 柑橘LCYb啟動(dòng)子互作因子的篩選
1 引言
2 材料與方法
2.1 實(shí)驗(yàn)材料
2.1.1 酵母菌株及質(zhì)粒
2.1.2 酵母實(shí)驗(yàn)中所使用的主要試劑
2.2 實(shí)驗(yàn)方法
2.2.1 酵母培養(yǎng)基及溶液配方
2.2.2 構(gòu)建誘餌載體pAbAi-Bait
2.2.3 獲得誘餌酵母菌株Y1HGold[pAbAi-Bait]
2.2.4 檢測(cè)誘餌酵母菌株的AbA最佳使用濃度
2.2.5 構(gòu)建cDNA文庫(kù)
2.2.6 酵母單雜交篩選文庫(kù)
2.2.7 陽(yáng)性克隆再篩選及測(cè)序分析
3 結(jié)果與分析
3.1 誘餌質(zhì)粒pAbAi-LP/C2P1/Ya/Yb的構(gòu)建
3.2 誘餌菌株Y1H[pAbAi-LP/C2P1/Ya/Yb]的獲得
3.3 檢測(cè)4個(gè)誘餌酵母菌株的AbA最佳使用濃度
3.4 甜橙果實(shí)cDNA文庫(kù)構(gòu)建
3.5 cDNA文庫(kù)篩選
3.6 陽(yáng)性克隆的序列分析
4 討論
4.1 酵母單雜交系統(tǒng)探討
4.2 篩選的幾個(gè)候選轉(zhuǎn)錄因子生物學(xué)功能探討
第五章 候選轉(zhuǎn)錄因子CsMADS6、CsMADS5和CsGARP4的功能分析
1 引言
2 材料與方法
2.1 實(shí)驗(yàn)材料
2.1.1 植物材料
2.1.2 菌株、質(zhì)粒和載體
2.2 實(shí)驗(yàn)方法
2.2.1 RNA提取及cDNA合成
2.2.2 基因克隆及序列分析
2.2.3 實(shí)時(shí)定量PCR
2.2.4 蛋白提取和Westernblot分析
2.2.5 亞細(xì)胞定位
2.2.6 酵母單雜(Y1H)
2.2.7 酵母雙雜(Y2H)
2.2.8 凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)(EMSA)
2.2.9 雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)(BiFC)
2.2.10 煙草瞬時(shí)表達(dá)及雙熒光素酶檢測(cè)
2.2.11 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的柑橘愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化
2.2.12 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的番茄遺傳轉(zhuǎn)化
2.2.13 轉(zhuǎn)基因材料陽(yáng)性系的鑒定
2.2.14 透射電鏡(TEM)
2.2.15 類胡蘿卜素提取及測(cè)定
2.2.16 葉綠素提取及測(cè)定
2.2.17 花青素提取及測(cè)定
2.2.18 磷含量提取及測(cè)定
2.2.19 RNA文庫(kù)構(gòu)建及測(cè)序
2.2.20 數(shù)據(jù)分析
3 轉(zhuǎn)錄因子CsMADS6的結(jié)果與分析
3.1 CsMADS6基因序列和蛋白特性分析
3.2 CsMADS6基因表達(dá)分析
3.3 CsMADS6蛋白亞細(xì)胞定位
3.4 CsMADS6蛋白轉(zhuǎn)錄活性分析
3.5 CsMADS6蛋白與LCYb1啟動(dòng)子互作分析
3.5.1 CsMADS6蛋白與LCYb1啟動(dòng)子互作的Y1H驗(yàn)證
3.5.2 CsMADS6蛋白與LCYb1啟動(dòng)子互作的EMSA驗(yàn)證
3.5.3 CsMADS6蛋白對(duì)LCYb1啟動(dòng)子活性的影響
3.6 柑橘愈傷CsMADS6超表達(dá)系類胡蘿卜素含量及基因表達(dá)分析
3.6.1 柑橘愈傷CsMADS6超表達(dá)系的獲得和表型分析
3.6.2 柑橘愈傷CsMADS6超表達(dá)系類胡蘿卜素含量分析
3.6.3 柑橘愈傷CsMADS6超表達(dá)系類胡蘿卜素基因表達(dá)分析
3.6.4 柑橘愈傷CsMADS6超表達(dá)系類胡蘿卜素相關(guān)TFs表達(dá)分析
3.7 CsMADS6蛋白與其他類胡蘿卜素基因啟動(dòng)子互作分析
3.7.1 CsMADS6蛋白與PSY、PDS和CCD1啟動(dòng)子互作的EMSA驗(yàn)證
3.7.2 CsMADS6蛋白對(duì)PSY、PDS和CCD1啟動(dòng)子活性的影響
3.8 番茄CsMADS6超表達(dá)系表型及生理生化分析
3.8.1 番茄CsMADS6超表達(dá)系的獲得和表型分析
3.8.2 番茄CsMADS6超表達(dá)系果皮和萼片類胡蘿卜素含量分析
3.8.3 番茄CsMADS6超表達(dá)系果皮和萼片質(zhì)體超微結(jié)構(gòu)分析
3.8.4 番茄CsMADS6超表達(dá)系果皮和萼片類胡蘿卜素基因表達(dá)分析
3.8.5 番茄CsMADS6超表達(dá)系萼片RNA-seq全基因組轉(zhuǎn)錄水平分析
4 轉(zhuǎn)錄因子CsMADS5的結(jié)果與分析
4.1 CsMADS5基因序列和表達(dá)分析
4.2 CsMADS5蛋白亞細(xì)胞定位
4.3 CsMADS5蛋白轉(zhuǎn)錄活性分析
4.4 CsMADS5蛋白與LCYb1啟動(dòng)子互作分析
4.4.1 CsMADS5蛋白與LCYb1啟動(dòng)子互作的Y1H驗(yàn)證
4.4.2 CsMADS5蛋白與LCYb1啟動(dòng)子互作的EMSA驗(yàn)證
4.4.3 CsMADS5蛋白對(duì)LCYb1啟動(dòng)子活性的影響
4.5 柑橘愈傷CsMADS5超表達(dá)系類胡蘿卜素含量及基因表達(dá)分析
4.5.1 柑橘愈傷CsMADS5超表達(dá)系的獲得和表型分析
4.5.2 柑橘愈傷CsMADS5超表達(dá)系類胡蘿卜素含量分析
4.5.3 柑橘愈傷CsMADS5超表達(dá)系類胡蘿卜素基因表達(dá)分析
4.6 CsMADS5蛋白與其他類胡蘿卜素基因啟動(dòng)子互作分析
4.6.1 CsMADS5蛋白與PSY、PDS和CCD1啟動(dòng)子互作的EMSA驗(yàn)證
4.6.2 CsMADS5蛋白對(duì)PSY、PDS和CCD1啟動(dòng)子活性的影響
4.7 番茄CsMADS5超表達(dá)系類胡蘿卜素含量及基因表達(dá)分析
4.7.1 番茄CsMADS5超表達(dá)系的獲得和表型分析
4.7.2 番茄CsMADS5超表達(dá)系果實(shí)中類胡蘿卜素含量分析
4.7.3 番茄CsMADS5超表達(dá)系果實(shí)中類胡蘿卜素基因表達(dá)分析
4.8 CsMADS6與CsMADS5蛋白互作分析
5 轉(zhuǎn)錄因子CsGARP4的結(jié)果與分析
5.1 CsGARP4基因序列和蛋白特性分析
5.2 CsGARP4基因表達(dá)分析
5.3 CsGARP4蛋白亞細(xì)胞定位
5.4 CsGARP4蛋白轉(zhuǎn)錄活性分析
5.5 CsGARP4蛋白與LCYb1啟動(dòng)子互作分析
5.5.1 CsGARP4蛋白與LCYb1啟動(dòng)子互作的Y1H驗(yàn)證
5.5.2 CsGARP4蛋白與LCYb1啟動(dòng)子互作的EMSA驗(yàn)證
5.5.3 CsGARP4蛋白對(duì)LCYb1啟動(dòng)子活性的影響
5.6 番茄CsGARP4超表達(dá)系表型及生理生化分析
5.6.1 番茄CsGARP4超表達(dá)系的獲得和表型分析
5.6.2 番茄CsGARP4超表達(dá)系葉片中CsGARP4及其同源基因表達(dá)分析
5.6.3 番茄CsGARP4超表達(dá)系葉片中類胡蘿卜素含量及基因表達(dá)分析
5.6.4 番茄CsGARP4超表達(dá)系葉片中花青素、葉綠素含量及基因表達(dá)分析
5.6.5 番茄CsGARP4超表達(dá)系葉片中磷含量及磷饑餓相關(guān)基因表達(dá)分析
6 討論
6.1 CsMADS6和CsMADS5是LCYb1直接正調(diào)控因子
6.2 CsMADS6和CsMADS5通過直接調(diào)控LCYb1、PSY、PDS和CCD1,從而協(xié)同調(diào)控類胡蘿卜素代謝
6.3 CsMADS6重排轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò),引導(dǎo)代謝流特異進(jìn)入類胡蘿卜素代謝通路
6.4 CsGARP4可能的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)理
第六章 總結(jié)與展望
參考文獻(xiàn)
附錄 I 部分實(shí)驗(yàn)方法
方法S1 DNA提取
方法S2 RNA提取
方法S3 cDNA合成
方法S4 qRT-PCR
方法S5 農(nóng)桿菌感受態(tài)制備及轉(zhuǎn)化
方法S6 酵母感受態(tài)制備及轉(zhuǎn)化
方法S7 雙熒光素酶檢測(cè)方法
方法S8 類胡蘿卜素提取和測(cè)定
附錄 Ⅱ部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果
附錄 III 博士期間發(fā)表論文
致謝
【參考文獻(xiàn)】：
博士論文
[1]GABA支路調(diào)控柑橘果實(shí)檸檬酸代謝的機(jī)理研究[D]. 盛玲.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2017
[2]水稻干旱響應(yīng)中表觀調(diào)控以及OsbZIP23介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究[D]. 宗偉.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2016
[3]轉(zhuǎn)基因調(diào)控柑橘類胡蘿卜素積累的細(xì)胞學(xué)和代謝研究[D]. 曹洪波.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2012
[4]甜橙（Citrus sinensis Osbeck）紅肉突變體類胡蘿卜素合成相關(guān)基因的克隆與特性分析[D]. 陶能國(guó).華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2006
[5]柑橘體細(xì)胞胞質(zhì)遺傳及葉綠體SSR引物開發(fā)研究[D]. 程運(yùn)江.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2004
[6]幾個(gè)柑桔產(chǎn)區(qū)果實(shí)色澤評(píng)價(jià)及紅肉臍橙（Citrus sinensis L.cv.Cara cara）果肉呈色機(jī)理初探[D]. 徐娟.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2002
碩士論文
[1]柑橘原生質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體系的建立及應(yīng)用[D]. 楊威.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2016
本文編號(hào)：3168258
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【學(xué)位級(jí)別】：博士
【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略詞表
第一章 前言
1 課題的提出
2 植物類胡蘿卜素代謝研究進(jìn)展
2.1 類胡蘿卜素簡(jiǎn)介
2.2 植物類胡蘿卜素代謝
2.2.1 植物類胡蘿卜素代謝途徑
2.2.2 植物類胡蘿卜素代謝途徑上主要結(jié)構(gòu)基因
2.2.3 影響植物類胡蘿卜素代謝的因素
2.3 植物類胡蘿卜素代謝的分子調(diào)控
2.3.1 轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控
2.3.2 其他分子水平調(diào)控
2.4 柑橘類胡蘿卜素代謝研究進(jìn)展
2.4.1 柑橘類胡蘿卜素代謝
2.4.2 柑橘類胡蘿卜素代謝與番茄紅素β-環(huán)化酶基因
3 本研究的目的和內(nèi)容
第二章 柑橘LCYb基因功能分析
1 引言
2 材料和方法
2.1 實(shí)驗(yàn)材料
2.2 實(shí)驗(yàn)方法
2.2.1 DNA提取、RNA提取及cDNA合成
2.2.2 基因克隆及序列分析
2.2.3 實(shí)時(shí)定量PCR
2.2.4 原核表達(dá)載體構(gòu)建及工程菌實(shí)驗(yàn)
2.2.5 細(xì)菌類胡蘿卜素提取及測(cè)定
2.2.6 點(diǎn)突變
3 結(jié)果與分析
3.1 甜橙LCYb基因表達(dá)分析
3.2 不同柑橘品種LCYb2基因序列的等位多態(tài)性分析
3.3 不同柑橘品種LCYb2環(huán)化酶活性分析
3.4 甜橙2個(gè)LCYb2等位基因的點(diǎn)突變分析
4 討論
4.1 柑橘中LCYb2基因的重要作用
4.2 柑橘LCYb2基因的等位多態(tài)性與不同柑橘品種的進(jìn)化關(guān)系有關(guān)
4.3 72 位和359位氨基酸是影響LCYb2酶活性的關(guān)鍵位點(diǎn)
第三章 柑橘LCYb啟動(dòng)子的克隆和活性分析
1 引言
2 材料與方法
2.1 實(shí)驗(yàn)材料
2.2 實(shí)驗(yàn)方法
2.2.1 DNA提取
2.2.2 啟動(dòng)子克隆
2.2.3 啟動(dòng)子序列生物信息學(xué)分析
2.2.4 啟動(dòng)子表達(dá)載體構(gòu)建
2.2.5 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的番茄果實(shí)瞬時(shí)轉(zhuǎn)化
2.2.6 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的擬南芥穩(wěn)定轉(zhuǎn)化
2.2.7 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的柑橘愈傷組織穩(wěn)定轉(zhuǎn)化
2.2.8 外源因子處理
2.2.9 GUS定性定量檢測(cè)
2.2.10 簡(jiǎn)單序列重復(fù)(SSR)標(biāo)記
2.2.11 數(shù)據(jù)分析
3 結(jié)果與分析
3.1 甜橙CsLCYb1啟動(dòng)子序列分析
3.2 瞬時(shí)表達(dá)番茄果實(shí)中CsLCYb1啟動(dòng)子活性分析
3.3 穩(wěn)定轉(zhuǎn)化擬南芥植株中CsLCYb1啟動(dòng)子活性分析
3.3.1 CsLCYb1不同啟動(dòng)子缺失片段的組織特異性活性分析
3.3.2 CsLCYb1全長(zhǎng)啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)基因擬南芥不同發(fā)育時(shí)期的活性分析
3.3.3 CsLCYb1不同啟動(dòng)子缺失片段在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的活性比較
3.4 穩(wěn)定轉(zhuǎn)化柑橘愈傷組織中CsLCYb1啟動(dòng)子活性分析
3.4.1 CsLCYb1不同啟動(dòng)子缺失片段在轉(zhuǎn)基因愈傷中的活性比較
3.4.2 CsLCYb1不同啟動(dòng)子缺失片段響應(yīng)外源因子處理的活性變化
3.5 CsLCYb1啟動(dòng)子精細(xì)缺失分析
3.6 其他柑橘品種LCYb1啟動(dòng)子序列分析
3.7 甜橙CsLCYb2啟動(dòng)子序列分析
3.8 瞬時(shí)表達(dá)番茄果實(shí)中CsLCYb2啟動(dòng)子活性分析
4 討論
4.1 CsLCYb1不同啟動(dòng)子缺失片段表達(dá)特點(diǎn)
4.2 CsLCYb1啟動(dòng)子響應(yīng)不同外源和內(nèi)源因子的表達(dá)特點(diǎn)
4.3 一個(gè)新的增強(qiáng)子元件與CsLCYb1啟動(dòng)子活性密切相關(guān)
4.4 不同柑橘品種LCYb1啟動(dòng)子上增強(qiáng)子元件拷貝數(shù)差異
4.5 CsLCYb2啟動(dòng)子分析為等位基因差異表達(dá)的分子機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)
第四章 柑橘LCYb啟動(dòng)子互作因子的篩選
1 引言
2 材料與方法
2.1 實(shí)驗(yàn)材料
2.1.1 酵母菌株及質(zhì)粒
2.1.2 酵母實(shí)驗(yàn)中所使用的主要試劑
2.2 實(shí)驗(yàn)方法
2.2.1 酵母培養(yǎng)基及溶液配方
2.2.2 構(gòu)建誘餌載體pAbAi-Bait
2.2.3 獲得誘餌酵母菌株Y1HGold[pAbAi-Bait]
2.2.4 檢測(cè)誘餌酵母菌株的AbA最佳使用濃度
2.2.5 構(gòu)建cDNA文庫(kù)
2.2.6 酵母單雜交篩選文庫(kù)
2.2.7 陽(yáng)性克隆再篩選及測(cè)序分析
3 結(jié)果與分析
3.1 誘餌質(zhì)粒pAbAi-LP/C2P1/Ya/Yb的構(gòu)建
3.2 誘餌菌株Y1H[pAbAi-LP/C2P1/Ya/Yb]的獲得
3.3 檢測(cè)4個(gè)誘餌酵母菌株的AbA最佳使用濃度
3.4 甜橙果實(shí)cDNA文庫(kù)構(gòu)建
3.5 cDNA文庫(kù)篩選
3.6 陽(yáng)性克隆的序列分析
4 討論
4.1 酵母單雜交系統(tǒng)探討
4.2 篩選的幾個(gè)候選轉(zhuǎn)錄因子生物學(xué)功能探討
第五章 候選轉(zhuǎn)錄因子CsMADS6、CsMADS5和CsGARP4的功能分析
1 引言
2 材料與方法
2.1 實(shí)驗(yàn)材料
2.1.1 植物材料
2.1.2 菌株、質(zhì)粒和載體
2.2 實(shí)驗(yàn)方法
2.2.1 RNA提取及cDNA合成
2.2.2 基因克隆及序列分析
2.2.3 實(shí)時(shí)定量PCR
2.2.4 蛋白提取和Westernblot分析
2.2.5 亞細(xì)胞定位
2.2.6 酵母單雜(Y1H)
2.2.7 酵母雙雜(Y2H)
2.2.8 凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)(EMSA)
2.2.9 雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)(BiFC)
2.2.10 煙草瞬時(shí)表達(dá)及雙熒光素酶檢測(cè)
2.2.11 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的柑橘愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化
2.2.12 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的番茄遺傳轉(zhuǎn)化
2.2.13 轉(zhuǎn)基因材料陽(yáng)性系的鑒定
2.2.14 透射電鏡(TEM)
2.2.15 類胡蘿卜素提取及測(cè)定
2.2.16 葉綠素提取及測(cè)定
2.2.17 花青素提取及測(cè)定
2.2.18 磷含量提取及測(cè)定
2.2.19 RNA文庫(kù)構(gòu)建及測(cè)序
2.2.20 數(shù)據(jù)分析
3 轉(zhuǎn)錄因子CsMADS6的結(jié)果與分析
3.1 CsMADS6基因序列和蛋白特性分析
3.2 CsMADS6基因表達(dá)分析
3.3 CsMADS6蛋白亞細(xì)胞定位
3.4 CsMADS6蛋白轉(zhuǎn)錄活性分析
3.5 CsMADS6蛋白與LCYb1啟動(dòng)子互作分析
3.5.1 CsMADS6蛋白與LCYb1啟動(dòng)子互作的Y1H驗(yàn)證
3.5.2 CsMADS6蛋白與LCYb1啟動(dòng)子互作的EMSA驗(yàn)證
3.5.3 CsMADS6蛋白對(duì)LCYb1啟動(dòng)子活性的影響
3.6 柑橘愈傷CsMADS6超表達(dá)系類胡蘿卜素含量及基因表達(dá)分析
3.6.1 柑橘愈傷CsMADS6超表達(dá)系的獲得和表型分析
3.6.2 柑橘愈傷CsMADS6超表達(dá)系類胡蘿卜素含量分析
3.6.3 柑橘愈傷CsMADS6超表達(dá)系類胡蘿卜素基因表達(dá)分析
3.6.4 柑橘愈傷CsMADS6超表達(dá)系類胡蘿卜素相關(guān)TFs表達(dá)分析
3.7 CsMADS6蛋白與其他類胡蘿卜素基因啟動(dòng)子互作分析
3.7.1 CsMADS6蛋白與PSY、PDS和CCD1啟動(dòng)子互作的EMSA驗(yàn)證
3.7.2 CsMADS6蛋白對(duì)PSY、PDS和CCD1啟動(dòng)子活性的影響
3.8 番茄CsMADS6超表達(dá)系表型及生理生化分析
3.8.1 番茄CsMADS6超表達(dá)系的獲得和表型分析
3.8.2 番茄CsMADS6超表達(dá)系果皮和萼片類胡蘿卜素含量分析
3.8.3 番茄CsMADS6超表達(dá)系果皮和萼片質(zhì)體超微結(jié)構(gòu)分析
3.8.4 番茄CsMADS6超表達(dá)系果皮和萼片類胡蘿卜素基因表達(dá)分析
3.8.5 番茄CsMADS6超表達(dá)系萼片RNA-seq全基因組轉(zhuǎn)錄水平分析
4 轉(zhuǎn)錄因子CsMADS5的結(jié)果與分析
4.1 CsMADS5基因序列和表達(dá)分析
4.2 CsMADS5蛋白亞細(xì)胞定位
4.3 CsMADS5蛋白轉(zhuǎn)錄活性分析
4.4 CsMADS5蛋白與LCYb1啟動(dòng)子互作分析
4.4.1 CsMADS5蛋白與LCYb1啟動(dòng)子互作的Y1H驗(yàn)證
4.4.2 CsMADS5蛋白與LCYb1啟動(dòng)子互作的EMSA驗(yàn)證
4.4.3 CsMADS5蛋白對(duì)LCYb1啟動(dòng)子活性的影響
4.5 柑橘愈傷CsMADS5超表達(dá)系類胡蘿卜素含量及基因表達(dá)分析
4.5.1 柑橘愈傷CsMADS5超表達(dá)系的獲得和表型分析
4.5.2 柑橘愈傷CsMADS5超表達(dá)系類胡蘿卜素含量分析
4.5.3 柑橘愈傷CsMADS5超表達(dá)系類胡蘿卜素基因表達(dá)分析
4.6 CsMADS5蛋白與其他類胡蘿卜素基因啟動(dòng)子互作分析
4.6.1 CsMADS5蛋白與PSY、PDS和CCD1啟動(dòng)子互作的EMSA驗(yàn)證
4.6.2 CsMADS5蛋白對(duì)PSY、PDS和CCD1啟動(dòng)子活性的影響
4.7 番茄CsMADS5超表達(dá)系類胡蘿卜素含量及基因表達(dá)分析
4.7.1 番茄CsMADS5超表達(dá)系的獲得和表型分析
4.7.2 番茄CsMADS5超表達(dá)系果實(shí)中類胡蘿卜素含量分析
4.7.3 番茄CsMADS5超表達(dá)系果實(shí)中類胡蘿卜素基因表達(dá)分析
4.8 CsMADS6與CsMADS5蛋白互作分析
5 轉(zhuǎn)錄因子CsGARP4的結(jié)果與分析
5.1 CsGARP4基因序列和蛋白特性分析
5.2 CsGARP4基因表達(dá)分析
5.3 CsGARP4蛋白亞細(xì)胞定位
5.4 CsGARP4蛋白轉(zhuǎn)錄活性分析
5.5 CsGARP4蛋白與LCYb1啟動(dòng)子互作分析
5.5.1 CsGARP4蛋白與LCYb1啟動(dòng)子互作的Y1H驗(yàn)證
5.5.2 CsGARP4蛋白與LCYb1啟動(dòng)子互作的EMSA驗(yàn)證
5.5.3 CsGARP4蛋白對(duì)LCYb1啟動(dòng)子活性的影響
5.6 番茄CsGARP4超表達(dá)系表型及生理生化分析
5.6.1 番茄CsGARP4超表達(dá)系的獲得和表型分析
5.6.2 番茄CsGARP4超表達(dá)系葉片中CsGARP4及其同源基因表達(dá)分析
5.6.3 番茄CsGARP4超表達(dá)系葉片中類胡蘿卜素含量及基因表達(dá)分析
5.6.4 番茄CsGARP4超表達(dá)系葉片中花青素、葉綠素含量及基因表達(dá)分析
5.6.5 番茄CsGARP4超表達(dá)系葉片中磷含量及磷饑餓相關(guān)基因表達(dá)分析
6 討論
6.1 CsMADS6和CsMADS5是LCYb1直接正調(diào)控因子
6.2 CsMADS6和CsMADS5通過直接調(diào)控LCYb1、PSY、PDS和CCD1,從而協(xié)同調(diào)控類胡蘿卜素代謝
6.3 CsMADS6重排轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò),引導(dǎo)代謝流特異進(jìn)入類胡蘿卜素代謝通路
6.4 CsGARP4可能的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)理
第六章 總結(jié)與展望
參考文獻(xiàn)
附錄 I 部分實(shí)驗(yàn)方法
方法S1 DNA提取
方法S2 RNA提取
方法S3 cDNA合成
方法S4 qRT-PCR
方法S5 農(nóng)桿菌感受態(tài)制備及轉(zhuǎn)化
方法S6 酵母感受態(tài)制備及轉(zhuǎn)化
方法S7 雙熒光素酶檢測(cè)方法
方法S8 類胡蘿卜素提取和測(cè)定
附錄 Ⅱ部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果
附錄 III 博士期間發(fā)表論文
致謝
【參考文獻(xiàn)】：
博士論文
[1]GABA支路調(diào)控柑橘果實(shí)檸檬酸代謝的機(jī)理研究[D]. 盛玲.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2017
[2]水稻干旱響應(yīng)中表觀調(diào)控以及OsbZIP23介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究[D]. 宗偉.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2016
[3]轉(zhuǎn)基因調(diào)控柑橘類胡蘿卜素積累的細(xì)胞學(xué)和代謝研究[D]. 曹洪波.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2012
[4]甜橙（Citrus sinensis Osbeck）紅肉突變體類胡蘿卜素合成相關(guān)基因的克隆與特性分析[D]. 陶能國(guó).華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2006
[5]柑橘體細(xì)胞胞質(zhì)遺傳及葉綠體SSR引物開發(fā)研究[D]. 程運(yùn)江.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2004
[6]幾個(gè)柑桔產(chǎn)區(qū)果實(shí)色澤評(píng)價(jià)及紅肉臍橙（Citrus sinensis L.cv.Cara cara）果肉呈色機(jī)理初探[D]. 徐娟.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2002
碩士論文
[1]柑橘原生質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體系的建立及應(yīng)用[D]. 楊威.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2016
本文編號(hào)：3168258
本文鏈接：http://www.sikaile.net/nykjlw/yylw/3168258.html
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