桂花(Osmanthus fragrans)隸屬于木犀科木犀屬(Osmanthus),又名九里香,是一種常綠闊葉的觀賞性喬木,植株較矮,也是我國(guó)的傳統(tǒng)名花之一。桂花在漢代就有人工種植的記載,在我國(guó)南方各省區(qū)均有野生和大面積人工種植的桂花。桂花具有獨(dú)特的芳香氣味,自古以來(lái)被廣泛應(yīng)用,如食品、香料、制茶、藥用等。另外,桂花在我國(guó)文化中有著美好的象征意義。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的自然生長(zhǎng)和人工栽培,桂花出現(xiàn)了許多不同的品種,分四個(gè)品種群:丹桂、銀桂、金桂和四季桂。在桂花的長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中,通過(guò)產(chǎn)生各種類型的次生代謝產(chǎn)物,桂花逐漸形成了一些抵御外界不良環(huán)境的獨(dú)特功能。這些次生代謝產(chǎn)物,在植物的整體代謝活動(dòng)中占據(jù)著十分重要的地位,同時(shí)又能夠留在植物體內(nèi)以便抵御一些病原微生物等外界物質(zhì)的侵害。本研究以銀桂品種白潔和橙紅丹桂盛花期的花瓣為材料,通過(guò)生理生化和分子生物學(xué)的方法,研究桂花的類黃酮代謝途徑,主要研究結(jié)果如下:(1)利用分光光度法和高效液相色譜技術(shù)對(duì)白潔和橙紅丹桂2個(gè)品種盛花期花瓣中總黃酮和槲皮素含量進(jìn)行分析檢測(cè),比較這兩種桂花品種花瓣中類黃酮和槲皮素積累量。通過(guò)檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),白潔花瓣中的類黃酮和槲皮素含量顯著高于橙紅丹桂。(2)利用RT-PCR和熒光定量PCR檢測(cè)類黃酮代謝途徑中相關(guān)基因的表達(dá)量,發(fā)現(xiàn)相比較橙紅丹桂,白潔花瓣中類黃酮代謝途徑上游基因PAL、CHS、F3H和FLS的表達(dá)量明顯上調(diào),而下游基因DFR和ANS表達(dá)量出現(xiàn)下調(diào)。這種基因表達(dá)量上的差異會(huì)導(dǎo)致白潔花瓣中類黃酮的積累。(3)構(gòu)建35S-OfMYB1-GFP-NOS重組載體,轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌,侵染桂花花瓣,提取RNA后,用RT-PCR和熒光定量PCR檢測(cè)類黃酮代謝途徑中相關(guān)基因的表達(dá)量,結(jié)果顯示:OfMYB1基因超表達(dá)后,促進(jìn)了PAL、CHI、FLS基因表達(dá)量的上調(diào),而基因DFR、ANS基因表達(dá)量出現(xiàn)了下調(diào)。說(shuō)明OfMYB1可能調(diào)控了這些基因的表達(dá)。(4)酵母單雜交實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)將pB42AD-ofMYB1和pLacZi-MBP重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化酵母后,培養(yǎng)后,經(jīng)過(guò)Z-buffer/X-gal染色后顯藍(lán)色,而對(duì)照共轉(zhuǎn)化pB42AD和pLacZi-MBP重組質(zhì)粒,經(jīng)培養(yǎng)和顯色后并不顯藍(lán)色,這一結(jié)果表明,OfMYB1能夠與OfPAL基因啟動(dòng)子區(qū)域的MYBPLANT元件相互作用,說(shuō)明OfMYB1可能參與了PAL基因表達(dá)的調(diào)控。(5)構(gòu)建原核蛋白表達(dá)載體pET-30a-OfMYB1,轉(zhuǎn)入BL21感受態(tài)細(xì)胞中,經(jīng)培養(yǎng)和誘導(dǎo)后,提取蛋白,聚丙烯酰胺凝膠電泳可以看到有25KD大小的OfMYB1蛋白目的條帶,而且隨誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng),蛋白量明顯增多。
【學(xué)位單位】：河南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：S685.13
【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
1 緒論
    1.1 類黃酮研究進(jìn)展
    1.2 類黃酮的基本結(jié)構(gòu)和分類
    1.3 類黃酮的生物學(xué)功能
        1.3.1 類黃酮對(duì)植物本身的作用
        1.3.2 對(duì)人類健康的作用
    1.4 類黃酮次生代謝的基本途徑
    1.5 類黃酮代謝過(guò)程中的酶
    1.6 轉(zhuǎn)錄因子
    1.7 酵母單雜交實(shí)驗(yàn)
    1.8 研究目的及意義
2 白潔和橙紅丹桂類黃酮含量分析
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器
    2.2 試驗(yàn)方法
        2.2.1 桂花花瓣中類黃酮的提取
        2.2.2 溶液的配制
        2.2.3 色譜條件
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)線性方程
        2.3.2 桂花總黃酮含量測(cè)定
        2.3.3 槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
        2.3.4 槲皮素含量的分析
    2.4 討論
3 類黃酮代謝途徑相關(guān)基因的表達(dá)分析
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 植物材料處理
        3.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑
        3.1.3 所用引物序列
    3.2 試驗(yàn)方法
        3.2.1 桂花花瓣RNA樣品的提取
        3.2.2 RNA的反轉(zhuǎn)錄
        3.2.3 RT-PCR分析基因的相對(duì)表達(dá)量
        3.2.4 熒光定量的實(shí)驗(yàn)流程
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 RT-PCR分析類黃酮代謝途徑中的相關(guān)基因表達(dá)量
        3.3.2 類黃酮代謝途徑相關(guān)基因表達(dá)量的熒光定量PCR分析
    3.4 討論
4 MYB1基因在白潔花瓣中超表達(dá)對(duì)類黃酮代謝途徑基因表達(dá)的影響
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.1.1 植物材料處理
        4.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑
        4.1.3 菌株與質(zhì)粒載體
        4.1.4 試劑和培養(yǎng)基的配制
        4.1.5 所用引物序列
    4.2 試驗(yàn)方法
        4.2.1 桂花花瓣RNA樣品的提取
        4.2.2 RNA的反轉(zhuǎn)錄
        4.2.3 雙鏈cDNA的合成
        4.2.4 擴(kuò)增片段的回收
        4.2.5 35S-OfMYB1-GFP-NOS超表達(dá)重組載體的構(gòu)建
        4.2.6 E.coli感受態(tài)細(xì)胞的制備與轉(zhuǎn)化
        4.2.7 農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化
        4.2.8 侵染桂花實(shí)驗(yàn)流程
        4.2.9 RT-PCR的實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.10 熒光定量PCR流程
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 35S-OfMYB1-GFP-NOS超表達(dá)重組載體的構(gòu)建
        4.3.2 MYB1基因相對(duì)表達(dá)量的RT-PCR分析
        4.3.3 熒光定量PCR分析MYB1基因超表達(dá)對(duì)類黃酮代謝途徑相關(guān)基因表達(dá)量的影響
    4.4 討論
5 酵母單雜交試驗(yàn)驗(yàn)證MYB1調(diào)控PAL基因的功能
    5.1 實(shí)驗(yàn)材料
        5.1.1 植物材料
        5.1.2 質(zhì)粒載體和菌株
        5.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑
        5.1.4 實(shí)驗(yàn)溶液
    5.2 實(shí)驗(yàn)方法
        5.2.1 花瓣RNA的提取
        5.2.2 RNA的反轉(zhuǎn)錄
        5.2.3 元件的合成
        5.2.4 pLacZi-MBP重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        5.2.5 pB42AD-ofMYB1重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        5.2.6 酵母感受態(tài)的制備和轉(zhuǎn)化
        5.2.7 酵母陽(yáng)性克隆的篩選
    5.3 結(jié)果與分析
        5.3.1 空質(zhì)粒pB42AD和空質(zhì)粒pLacZi的酶切結(jié)果
        5.3.2 pB42AD-ofMYB1和pLacZi-MBP重組載體的構(gòu)建
        5.3.3 酵母單雜交陽(yáng)性克隆的顯色
    5.4 討論
6 OfMYB1轉(zhuǎn)錄因子的原核蛋白表達(dá)
    6.1 實(shí)驗(yàn)材料
        6.1.1 植物材料
        6.1.2 質(zhì)粒載體與菌株
        6.1.3 溶液
    6.2 實(shí)驗(yàn)方法
        6.2.1 BL21 （DE3）感受態(tài)細(xì)胞的制備
        6.2.2 PET30a-OfMYB1重組載體的構(gòu)建
        6.2.3 重組載體原核蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
        6.2.4 SDS-PAGE凝膠電泳、染色及脫色
    6.3 結(jié)果與分析
        6.3.1 pET30a-OfMYB1重組載體的構(gòu)建
        6.3.2 PET30a-OfMYB1重組蛋白的表達(dá)
    6.4 討論
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄

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