石蒜科(Amaryllidaceae)石蒜屬(Lycoris)為東亞特有的多年生球根花卉,具有重要的觀賞、藥用及生態(tài)價值。中國是石蒜屬植物的主要分布產(chǎn)地,其中又以占據(jù)了全國80%以上種質(zhì)的浙江、江蘇省等,為石蒜屬植物種質(zhì)資源的多樣化分布中心。石蒜屬植物花色豐富、花型獨特,已逐漸成為了優(yōu)良的鮮切花、盆花及園林景觀配置材料。然而由于受到幼年生長期長、自然繁殖率低的限制,自然繁殖方式已不能滿足持續(xù)增長的鱗莖需求量,并且大規(guī)模的鱗莖采挖,已經(jīng)對石蒜屬植物野生資源造成了嚴(yán)重破壞,高效人工繁育體系的建立迫在眉睫。本研究以目前園林應(yīng)用廣泛的兩種石蒜屬植物:換錦花(Lycoris sprengeri,Ls)及忽地笑(Lycoris aurea,La)為研究材料,基于氣培條件下的鱗莖塊繁殖法,從形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)、亞細(xì)胞學(xué)、生理水平上對石蒜屬植物的小鱗莖發(fā)生及發(fā)育過程展開比較研究。首次在石蒜屬植物研究中結(jié)合PacbioIso-seq和Illumina RNA-seq進(jìn)行聯(lián)合測序,構(gòu)建了石蒜屬植物全長參考轉(zhuǎn)錄組及小鱗莖發(fā)生及發(fā)育相關(guān)基因池數(shù)據(jù)庫,并基于該平臺系統(tǒng)地進(jìn)行了種間及種內(nèi)兩種比較模式下的差異表達(dá)基因篩選及功能分析,初步揭示了創(chuàng)傷誘導(dǎo)的乙烯生物合成及其信號傳導(dǎo)與小鱗莖發(fā)生能力間的相關(guān)性,將研究目標(biāo)聚焦在基盤切割造成的創(chuàng)傷刺激引起的乙烯生物合成及其信號傳導(dǎo)、植物創(chuàng)傷響應(yīng)反應(yīng)與創(chuàng)傷誘導(dǎo)的植物再生關(guān)系中。本研究為進(jìn)一步解析石蒜屬植物小鱗莖發(fā)生及發(fā)育的分子機理,以及有效推動原產(chǎn)于我國的野生球根花卉的人工繁育體系構(gòu)建及種球商品化育種的實現(xiàn)具有重要意義。主要研究結(jié)果概括如下:1.氣培條件下石蒜屬植物小鱗莖發(fā)生及發(fā)育階段確定為了探究在自然條件下的石蒜屬植物小鱗莖發(fā)生及發(fā)育過程,在不添加外源植物生長調(diào)節(jié)劑的情況下,通過基盤切割處理誘導(dǎo)小鱗莖發(fā)生的方式建立了氣培小鱗莖發(fā)生及發(fā)育研究體系,并從形態(tài)學(xué)、組織學(xué)、亞細(xì)胞學(xué)、生理水平等層面展開種間對比研究,首次將氣培條件下的石蒜屬植物小鱗莖發(fā)生及發(fā)育過程劃分為四個主要階段:(1)早期感受階段(0-3d),(2)腋芽萌發(fā)及伸長階段(3-9d),(3)小鱗莖形成階段(9-15d),(4)小鱗莖發(fā)育及膨大階段(15-45d)。并基于再生小鱗莖數(shù)量統(tǒng)計分析,將兩者分別定義為高增殖率表型(Ls)和低增殖率表型(La)。同時,經(jīng)由該體系確定的小鱗莖發(fā)生方式、發(fā)生組織部位以及發(fā)生關(guān)鍵時期,為后續(xù)轉(zhuǎn)錄組測序取樣點的選擇提供了充分的數(shù)據(jù)支持。2.基于“腋芽起源”的小鱗莖發(fā)生方式確定本研究基于氣培體系證實了石蒜屬植物小鱗莖的腋芽發(fā)育起源方式。并基于小鱗莖于鱗片遠(yuǎn)軸端連接基盤處組織發(fā)生的特點,揭示了基盤結(jié)構(gòu)在這一過程中的必要性。同時,氣培體系還揭示了石蒜屬植物“由頂向基”的小鱗莖發(fā)生方式,即由內(nèi)層鱗片向外層鱗片發(fā)生;亞細(xì)胞學(xué)分析進(jìn)一步揭示了淀粉粒在這一過程中的旺盛代謝活動,表明在受到基盤切割刺激后,細(xì)胞中淀粉代謝響應(yīng)的迅速性,也首次將球根花卉小鱗莖發(fā)生及發(fā)育這一生物學(xué)過程的研究聚焦到發(fā)生前期無肉眼可見形態(tài)變化的感受態(tài)階段(0～6h)。3.聯(lián)合測序構(gòu)建石蒜屬植物全長參考轉(zhuǎn)錄組基于建立的氣培發(fā)生研究體系和劃分的四個主要生長階段,對兩個種的小鱗莖發(fā)生及發(fā)育過程進(jìn)行了時間序列的對比取樣(Oh,6h,48h,6d,15d,27d,36 d),在石蒜屬植物研究中首次結(jié)合Pacbio Iso-seq及Illumina RNA-seq開展雙平臺聯(lián)合測序,通過分平臺測序并整合兩平臺測序結(jié)果,構(gòu)建獲得了石蒜屬植物的全長參考轉(zhuǎn)錄組。利用Illumina HiSeq Xten轉(zhuǎn)錄組測序平臺完成了換錦花及忽地笑兩個種7個時期共計42個樣品的測序,共得到352.12Gb原始下機數(shù)據(jù)(Clean Data)。經(jīng)過進(jìn)一步質(zhì)控后共獲得Final cleaned reads換錦花為486,423,193條,忽地笑為526,792,197條。其中,換錦花的Final cleaned reads被進(jìn)一步用于校正Pacbio Iso-seq數(shù)據(jù)中的低質(zhì)量序列,該平臺共獲得轉(zhuǎn)錄本序列258,031條。七個均勻選自小鱗莖發(fā)生及發(fā)育階段的樣品等量混合后于Pacbio RS II平臺進(jìn)行全長轉(zhuǎn)錄組測序,獲得Clean data共計10.39 Gb。其中低質(zhì)量序列經(jīng)由Illumina clean reads進(jìn)一步校正,聯(lián)合高質(zhì)量序列共同去冗余后獲得全長轉(zhuǎn)錄本序列37,518條。經(jīng)過兩平臺數(shù)據(jù)整合及質(zhì)控后,獲得最終Finaltranscriptome assembly包含全長轉(zhuǎn)錄本序列285,128條,預(yù)測基因數(shù)量為204,933個。以構(gòu)建的“參考轉(zhuǎn)錄組”為參,獲得Illumina平臺所得Clean reads的比對率分別為76.75%(換錦花)和68.35%(忽地笑)。共鑒定獲得轉(zhuǎn)錄因子及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子分別為4,074個及1,262個。通過與多個蛋白數(shù)據(jù)庫比對,及GO和KO注釋,獲得了全長轉(zhuǎn)錄本的基因注釋結(jié)果。4.石蒜屬植物小鱗莖發(fā)生及發(fā)育過程中的比較轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析本研究采用ImpulseDE2方法分別獲得種間差異表達(dá)基因(Differentially expressed gene,DEG)112,779個(Lavs Ls),種內(nèi)DEG為換錦花67,973個,忽地笑36,251個。全局熱圖分析揭示了基盤切割處理后6h基因表達(dá)的顯著性差異,表明轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控和種間差異的發(fā)生遠(yuǎn)早于形態(tài)變化的出現(xiàn),其中6 h瞬時上調(diào)表達(dá)基因在換錦花中占比最大,而瞬時下調(diào)表達(dá)基因則是忽地笑中占比最大的部分。KEGG富集分析獲得的與乙烯生物合成密切相關(guān)的代謝途徑、氨基酸生物合成、半胱氨酸和蛋氨酸代謝在兩種中表現(xiàn)出基因表達(dá)模式的顯著差異,初步揭示了高增殖率表型與活躍乙烯生物合成的密切相關(guān)性,并首次提出了創(chuàng)傷誘導(dǎo)的內(nèi)源乙烯合成在石蒜屬植物小鱗莖發(fā)生及發(fā)育過程中的重要作用。(1)小鱗莖發(fā)生促進(jìn)型中活躍的乙烯生物合成及信號傳導(dǎo)本研究首次提出了應(yīng)對基盤切割的活躍的乙烯生物合成及信號傳導(dǎo)與石蒜屬植物小鱗莖發(fā)生能力緊密相關(guān)。種間表達(dá)量對比分析揭示了乙烯生物合成及信號傳導(dǎo)路徑關(guān)鍵基因ACO,ACS,ERS1,ERS2,ETRI,ETR2,EIN4,CTR1,-EIN2,EIN3/EIF1在高增殖率表型(Ls)中的顯著上調(diào)表達(dá)模式,表明活躍的乙烯合成可能對創(chuàng)傷誘導(dǎo)的小鱗莖發(fā)生具有一定促進(jìn)作用。并基于乙烯的創(chuàng)傷響應(yīng)性,通過分析創(chuàng)傷響應(yīng)相關(guān)基因進(jìn)一步揭示了快速的創(chuàng)傷響應(yīng)能力與小鱗莖發(fā)生能力間的相關(guān)性;(2)基盤切割的雙重作用不同于傳統(tǒng)研究中基盤切割破壞頂芽,從而促進(jìn)腋芽萌發(fā)的研究方向,本研究基于創(chuàng)傷響應(yīng)相關(guān)基因ANAC071、RAP2.6L、ACS2、LOX2等在高增殖率表型(Ls)中的快速響應(yīng)性,揭示了基盤切割在石蒜屬植物小鱗莖發(fā)生及發(fā)育過程中的“雙重作用”:一方面基盤切割消除了鱗莖內(nèi)部的頂端優(yōu)勢,通過調(diào)控生長素轉(zhuǎn)運促進(jìn)小鱗莖(腋芽)萌發(fā);另一方面基盤切割造成的創(chuàng)傷可能作為一種信號啟動并促進(jìn)了小鱗莖(腋芽)發(fā)生。同時,占比最高的轉(zhuǎn)錄因子(TF)和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子(TR)家族的ERF和AUX/IAA共同揭示了乙烯和生長素在石蒜屬植物小鱗莖發(fā)生及發(fā)育過程中的關(guān)鍵參與性,并提出生長素對小鱗莖發(fā)生的調(diào)控可能經(jīng)由響應(yīng)生長素而產(chǎn)生的乙烯介導(dǎo),而作為一種防御性響應(yīng)激素,乙烯的合成又對生長素轉(zhuǎn)運產(chǎn)生影響,二者相互作用,共同參與調(diào)控石蒜屬植物小鱗莖的發(fā)生及發(fā)育。
【學(xué)位單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S682.2
【部分圖文】：

我國石蒜屬植物資源豐富，但其基本上都處于野生狀態(tài)。并且，隨著近年來??園林景觀及藥物研發(fā)的大量需求，石蒜屬植物鱗莖的人工采挖量不斷增加，然而??由于受到自然繁殖條件下增殖系數(shù)低、鱗莖發(fā)育周期長等因素的限制（圖１．１），??自然繁殖方法已無法滿足日益增長的鱗莖需求量，這不僅阻礙了石蒜屬植物的進(jìn)??一步廣泛應(yīng)用及資源開發(fā)，還導(dǎo)致了其野生鱗莖資源數(shù)量的顯著下降，并且這已??經(jīng)對石蒜屬植物的資源保護(hù)構(gòu)成了明顯威脅（常樂等，２０１１）。同時，石蒜屬植??物的這一生長特點也是長期以來制約該屬植物人工繁育、新品種培育以及種球產(chǎn)??業(yè)化繁育的限制因素（常樂，２０１１；余琳芳，２０１４）。??目前，石蒜屬植物的研究主要集中于組織培養(yǎng)（林田，２００６；呂玉華，２００５；??龍祥友，２００９；鞏檑，２０１２；余琳芳，２０１４；劉旭析，２０１５）、核型分析（邵建??章等，１９９４；任秀芳等，１９９５；余本棋等，２００４；余本褀

２００７；鞏檑，２０１２），吟片（Ｂｌｏｍｅｒｕｓａｎｄ?Ｓｃｈｒｅｕｄｅｒ，?２００２；?Ｂａｃｃｈｅｔｔａ，ｅｔａｌ．，??２００３；時劍，２０１１），和各類花器官（Ｚ：ｉｖａｎｄＬｉｌｉｅｎ－Ｋｉｐｎｉｓ，２０００；劉雅莉，２００４；??佘琳芳，２０１４）等。根據(jù)發(fā)育過程分類（圖１．２），組織培養(yǎng)可劃分為直接形態(tài)??發(fā)生（Ｄｉｒｅｃｔ?ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ?）和間接形態(tài)發(fā)生（Ｉｎｄｉｒｅｃｔ?ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ?）兩種類型。??其中，直接形態(tài)發(fā)生包括通過外植體中已經(jīng)存在的腋生分生組織的發(fā)育，不定分??生組織犮生或體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑形成新個體。而上述發(fā)育方式中的后兩種又可??以通過先形成愈傷組織，后經(jīng)愈傷組織分化再形成不定分生組織或體細(xì)胞胚胎，??４??

１．２石蒜屬植物繁育現(xiàn)狀??１．２．１石蒜屬植物自然繁殖??石蒜屬植物在自然條件下一般以分球繁殖為主（圖１．３），由于鱗莖中心頂??芽結(jié)構(gòu)的存在，頂端優(yōu)勢作用顯著，腋芽形成受到抑制，只有當(dāng)成熟鱗莖進(jìn)入生??殖生長期，分化形成的花芽抑制了頂端優(yōu)勢作用時，鱗莖才具有分球能力，從而??萌發(fā)形成腋芽（陳泓偉，２００７）。并且石蒜屬植物繁殖系數(shù)較低，自然分球率僅??有１．８倍（呂美麗等，１９８８），其中根據(jù)種類的不同，每年分生１？２個子鱗莖不??等，子鱗莖生長為成熟開花鱗莖還需要經(jīng)歷３？４年。若以種子繁殖則歷時更長，??需要進(jìn)行４？５年的營養(yǎng)生長（呂玉華
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2849488