甘藍(Brassica oleracea L.var.capitata L.)是一種重要的兩年生蔬菜,屬于十字花科蕓薹屬甘藍種。甘藍在產量、品質、抗病性、抗逆性等性狀上具有明顯的雜種優(yōu)勢。雜種優(yōu)勢育種已成為甘藍品種改良的主要方式。雄性不育突變體在甘藍雜種優(yōu)勢利用中發(fā)揮著重要作用,同時也是研究植物生殖發(fā)育調控的重要材料。83121A雄性不育材料是本課題組在育種過程中發(fā)現(xiàn)的隱性單核基因突變體。本研究以83121A為材料,研究了雄性不育發(fā)生的時期及細胞學特征,對雄性不育基因進行了克隆與功能驗證,同時利用轉錄組和蛋白組技術探討了雄性不育發(fā)生的分子機理,為該突變體材料在甘藍育種中的應用奠定了基礎。主要研究結果如下:1.83121A營養(yǎng)生長正常,花朵可以正常開放,蜜腺發(fā)育正常,花蜜較多,但花藥敗育徹底,無花粉。通過石蠟切片觀察發(fā)現(xiàn),83121A可正常形成四分體,四分小孢子釋放后,絨氈層提前降解,小孢子的發(fā)育停滯在單核期并最終降解;另外,利用掃描電鏡和透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn),不育材料的絨氈層液泡化嚴重,幾乎檢測不到絨氈層小體的存在,且83121A小孢子從四分體釋放后無法形成花粉外壁,推測花粉外壁的缺失是小孢子敗育的主要原因。2.利用轉錄組測序技術分析了不育系83121A及其近等基因可育系83121B小孢子雙核期之前花蕾的基因表達,共得到2881個差異表達基因,其中在83121A中上調表達的有1310個,下調表達的有1571個。通過分析花粉外壁合成相關基因在83121AB中的表達,將與擬南芥CYP704B1同源的基因Bol023932確定為重要候選基因,并命名為BoCYP704B1,該基因在83121A花蕾中的表達受到嚴重抑制。3.BoCYP704B1在野生型甘藍花藥及絨氈層中特異表達,其表達量在四分體時期和單核早期達到最大,以后逐漸減弱至終止;亞細胞定位結果表明該蛋白定位在內質網中。BoCYP704B1與擬南芥CYP704B1、水稻CYP704B2同源性較高,目前已知CYP704B1和CYP704B2均催化中長鏈脂肪酸的羥基化,據(jù)此推測,BoCYP704B1可能編碼脂肪酸羥基化酶,參與花粉外壁合成。4.通過克隆測序發(fā)現(xiàn),83121A中BoCYP704B1基因的第一個外顯子中插入一段5424bp的Ty3-gypsy類型反轉錄轉座子;轉座子的插入一方面抑制了該基因的表達,另一方面改變了轉錄剪切位點,使編碼蛋白結構發(fā)生變化,喪失生物學功能。5.根據(jù)BoCYP704B1突變設計基因內分子標記進行連鎖分析發(fā)現(xiàn),純合BoCYP704B1突變總是與雄性不育性狀連鎖,說明該基因突變是導致雄性不育的根本原因,開發(fā)的分子標記可以用于不育材料的輔助選擇。另外通過轉基因互補試驗證明了BoCYP704B1可以恢復83121A的育性,是隱性核不育系83121A的恢復基因,可利用BoCYP704B1通過基因工程技術創(chuàng)制雄性不育保持系。6.采用高通量非標記定量蛋白質組學label-free的方法對83121A和83121B小孢子雙核期之前的花蕾進行差異蛋白質組學分析,鑒定出1245個差異表達蛋白質,其中648個蛋白在83121A中下調表達。這些差異蛋白的生物學功能主要涉及花粉壁合成,脂肪酸代謝,氨基酸合成以及蛋白質加工修飾,表明這些代謝途徑對于甘藍生殖發(fā)育具有重要的作用。
【學位單位】：中國農業(yè)科學院
【學位級別】：博士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：S635
【部分圖文】：

業(yè)科學院博士學位論文 第一章 數(shù)分裂，產生四個染色體數(shù)目減半的單倍體小孢子，這 4 個小孢子由胼胝質包裹，聚集即四分體（圖 1.1 Stage 7）。在四分體形成的同時，中間層細胞發(fā)生降解。四分體形成殊信號的調控下，絨氈層細胞開始合成胼胝質酶，并將其分泌至藥室內對胼胝質壁進行孢子從四分體中游離出來。這時的小孢子只有一個細胞核（圖 1.1 Stage 8）。絨氈層為育提供充足的水分和營養(yǎng)，單核小孢子發(fā)育過程中逐漸液泡化，產生中央大液泡，原先中央的細胞核被擠到一側（圖 1.2 Stage 9-10）。同時，花粉外壁逐漸形成，絨氈層慢慢 1.2 Stage 9-10）。受細胞核極性的影響，單核小孢子發(fā)生一次不均等有絲分裂，形成一的營養(yǎng)細胞包含一個較小的生殖細胞的結構，即二細胞花粉（Honys et al., 2006）。生殖步發(fā)育，并通過均等的有絲分裂產生兩個精細胞，此時的花粉為一個大的營養(yǎng)細胞內含胞的三細胞結構，即三細胞花粉。隨著二細胞花粉的形成，絨氈層降解產生的脂類、蛋色素等物質在花粉表面累積，形成花粉外被；隨后三細胞花粉發(fā)生脫水，便于與花粉外結合，形成成熟花粉粒（圖 1.2 Stage 11）。與此同時，藥室內側的內壁細胞失水干裂，脫落，釋放出成熟花粉粒（圖 1.2 Stage 12-14）。

圖 1.2 擬南芥花藥發(fā)育（二）（Sanders et al., 1999）Figure 1.2 Anther development of Arabidopsis thaliana (II)絨氈層發(fā)育及調控研究進展氈層是在開花植物花藥中發(fā)現(xiàn)的一層位于花粉小孢子與花藥壁之間的特殊營養(yǎng)細胞（L2 層和 L3 層）的孢原細胞及連接組織分化發(fā)育而來，細胞體積通常較大并且具（Esau, 1977; Mascarenhas, 1990）。絨氈層擁有極性分泌功能，減數(shù)分裂和小孢子養(yǎng)物質（蛋白質、脂質、糖類等物質）、分解四分體所需的胼胝質酶、花粉壁前體氈層細胞中特異合成，再分泌至藥室內以確保花粉的正常發(fā)育（Steiglitz, 1977; MascBedinger, 1992; Wu et al., 1997; Piffanelli et al., 1998）。研究表明，絨氈層細胞中發(fā)生異常都有可能直接引起小孢子敗育或導致育性下降（宋江華 等，2008; Huang et al.,

圖 1.3 絨氈層發(fā)育調控網絡（Liu et al., 2013）Figure 1.3 Regulatory network of tapetum development (Liu et al., 2013)分子遺傳學研究已在擬南芥和水稻等模式植物中克隆了多個對絨氈層形成和因，并構建了絨氈層發(fā)育調控網絡（圖 1.3）（Liu & Fan, 2013）。在花藥原形成階段，AP3、PI、AG、SPL/NZZ、EMS1/EXS、TPD1、SERK1、SERK2、BA揮了關鍵作用。在花器官 ABC 發(fā)育模型中，B 類基因 AP3/PI 和 C 類基因 A發(fā)育（Ma 2005; Wellmer et al., 2006）。此外，植物花藥發(fā)育還需要 ABC 模調控，其中較早發(fā)揮作用的基因 SPL/NZZ 是花藥孢子囊形成及細胞增殖haler et al., 1999;Yang et al., 1999）。SPL/NZZ 編碼一種 MADS 盒類轉錄因子藥發(fā)育早期表達（Ito et al. 2004; Liu et al. 2009）。在 spl/nzz 突變體中，花藥分化發(fā)育異常，無法形成小孢子及中層、絨氈層等藥壁結構，推測在小孢子能夠通過激活下游基因來調控花藥細胞分化（Schiefthaler et al., 1999; Yang manian & Schneitz 2000, 2002）。在花藥早期發(fā)育過程中，細胞特化/分化還離不MS1/EXS、SERK1、SERK2、TPD1 等基因的調控（Canales et al. 2002; Zhao et al.; Albrecht et al. 2005; Colcombet et al. 2005; Hord et al. 2006; Mizuno et al. 20
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本文編號：2841413