番茄是世界上種植最廣泛的蔬菜作物之一,也是研究植物生殖發(fā)育的模式植物。前人研究表明,植物花粉發(fā)育及授粉時期對外界環(huán)境極度敏感是限制番茄坐果的主要因子,因而研究花粉發(fā)育對于番茄抗性品種的選育以及栽培技術的改良具有重要意義。促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)在植物逆境響應與生長發(fā)育過程中發(fā)揮多種功能。然而關于它們在植物生殖生長發(fā)育過程中的功能研究涉及不多。在本實驗室的前期研究中,我們分離了番茄SlMAPK家族的16個基因,初步鑒定了一批在番茄生殖發(fā)育過程中優(yōu)勢表達的S1MAPK基因。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)了一個植物特有的TDY MAPK,SlMPK20,專一作用于番茄減數(shù)分裂后花粉發(fā)育過程。SlMPK20在雄蕊中優(yōu)勢表達,在雙核期花粉中表達量達到最大值。通過RANi-介導的對SlMPK20的抑制或利用CRISPR/Cas9對SlMPK20的敲除,可育花粉顯著性減少或完全消失,但其對植物營養(yǎng)生長和雌性生殖生長都沒有影響。顯微觀察和基因表達分析表明,SlMPK20在單核花粉發(fā)育時期發(fā)揮功能,隨后我們利用轉錄組分析、生化分析以及分子生物學等手段研究了該基因調控番茄花粉發(fā)育的分子機制,為深入闡明番茄花粉發(fā)育的控制機理奠定了基礎,并為利用遺傳工程技術調控番茄育性提供了理論依據(jù)。獲得的主要結果如下:(1)利用qRT-PCR技術發(fā)現(xiàn)SlMPK20在番茄不同組織中均有表達,在雄蕊中優(yōu)勢表達;同時SlMPK20在不同發(fā)育時期雄蕊中均有表達,但在單核中后期至雙核期表達量最高。原位雜交分析發(fā)現(xiàn)在四分體至雙核期的花粉囊及花粉中均能檢測到SlMPK20的轉錄本。分離SlMPK20啟動子并進行GUS染色觀察發(fā)現(xiàn),SlMPK20啟動子在擬南芥花序中表達強烈,進一步冷凍切片觀察發(fā)現(xiàn)SlMPK20啟動子信號清楚地出現(xiàn)在四分體時期至雙核期。通過原核誘導表達實驗及Western-Blot分析發(fā)現(xiàn)SlMPK20能夠編碼一個水溶性的大約70.5 KDa的蛋白質;亞細胞定位證實該編碼蛋白遍在分布于細胞核、細胞膜和細胞質中。(2)利用RNAi技術和CRISPR/Cas9敲除系統(tǒng)分別獲得了SlMPK20下調表達與特異敲除的番茄“Micro-Tom”轉基因株系。觀察發(fā)現(xiàn)抑制SlMPK20表達可導致約有80%的花粉敗育,SlMPK20的敲除導致花粉粒幾乎完全敗育,同時發(fā)現(xiàn)SlMPK20的過表達植株生長與發(fā)育無異常;將野生型花粉授在CR-SlMPK20以及RNAi-SlMPK20轉基因植株柱頭上,轉基因植株能夠正常坐果與結籽,且種子能正常萌發(fā),表明SlMPK20的抑制或敲除對植株營養(yǎng)生長與雌性生殖生長并無明顯影響,SlMPK20專一地作用于番茄雄性生殖發(fā)育過程中。細胞學觀察以及DAPI染色均發(fā)現(xiàn)SlMPK20抑制或敲除轉基因植株的花粉粒敗育發(fā)生在從單核小孢子向雙核小孢子轉變的過程中。CR-SlMPK20轉基因植株花粉粒在花粉小孢子母細胞時期至單核早期均發(fā)育正常,但在單核中期開始高度液泡化,且在單核后期加劇,至雙核期大部分細胞質與細胞核降解,直至成熟期花粉內含物完全降解,花粉粒坍塌皺縮。(3)利用RNA-seq技術比較CR-SlMPK20、RNAi-SlMPK20轉基因植株與野生型植株雄蕊在不同發(fā)育時期基因表達的變化。轉錄組測序數(shù)據(jù)表明,與野生型相比,在四分體時期至單核早期(花粉敗育之前),敲除SlMPK20使大量控制糖代謝和糖運輸?shù)幕蛞约吧L素(IAA)植物激素信號傳導基因顯著下降;同樣,在花粉敗育顯現(xiàn)的單核中后期,下調或敲除SlMPK20導致大量參與糖代謝與糖信號轉導、植物激素(IAA和JA)合成和信號轉導的基因發(fā)生顯著性變化。然而生化分析表明蔗糖含量在四分體至單核早期、單核中后期均顯著上調,內源激素IAA與JA在單核中后期與雙核期均顯著性下降。所以,下調或敲除SlMPK20可能從轉錄水平上調控糖代謝與激素信號相關基因的表達水平從而誘發(fā)番茄花粉敗育。(4)酵母雙雜交及雙分子熒光互補實驗證明了 SlMKK4與SlMPK20,SlMPK20與SlMYB32蛋白之間存在互作。且SlMPK20能夠被SlMKK4體外磷酸化。由此提出一條新的在植物花粉發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用的MAPK級聯(lián)途徑:SlMKK4-SlMPK20-SlMYB32。蛋白定量組學分析結果與轉錄組測序分析結果相符,碳水化合物代謝酶在SlMPK20調控番茄減數(shù)分裂后花粉發(fā)育中發(fā)揮重要作用。SlMPK20可能通過改變SlMYB32的磷酸化水平進而調控花粉糖代謝和糖信號相關基因、植物激素合成及信號傳導相關基因的轉錄水平和蛋白水平,從而調控番茄減數(shù)分裂后花粉發(fā)育進程。
【學位單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：S641.2
【部分圖文】：

浙江大學博士學位論文?１文獻綜述：高等植物ＭＡＰＫｓ功能與花粉發(fā)育研宄進展??子母細胞分化并經(jīng)過兩輪的減數(shù)分裂后（ｍｅｉｏｓｉｓ）形成四分體，隨著胼胝質的降解，??小孢子從四分體中游離出來的過程；雄配子發(fā)生期（ｍｉｃｒｏｇａｍｅｔｏｇｅｎｅｓｉｓ）即自由小??孢子減數(shù)分裂后的發(fā)育形成成熟花粉的過程（ｐｏｓｔ－ｍｅｉｏｓｉｓ）?（Ｍａｓｃａｒｅｎｈａｓ，?１９８９；??Ｙａｍａｍｏｔｏ?ｅｔ?ａｌ．，?２００３；?Ｄｕｒｂａｒｒｙ?ｅｔ?ａｉ，?２００５；?Ｗｉｌｓｏｎ?ａｎｄ?Ｚｈａｎｇ，?２００９；?Ｄｅｖｅｓｈｗａｒ?ｅｔ?ａｉ，??２０１１；Ｔｗｅｌｌ，２０１１；?Ｃｈｅｕｎｅｔ?ａｌ．，?２０１３．??

??＾?ｌｉｒａｎａｉｕｒｅ?ｐｏｌｌｅｎ?ｇｒａｉｎ??嫌??圖１．丨多數(shù)被子植物典型的小孢子發(fā)育過程（改自Ｍｃｘｏｒｍｋｋ?１９９３）?？??Ｆｉｇ．?１．１?Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｏｆ?ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｏｇｅｎｃｓｉｓ?ｔｙｐｉｃａｌ?ｐｒｏｃｅｓｓ?ｉｎ?ｍｏｓｔ?ａｎｇｉｏｓｐｅｒｍｓ?（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ??ｆｒｏｍ?Ｍｃｃｏｒｍｉｃｋ，?１９９３）．??在開花植物中，雄配子發(fā)生期被嚴格的定義為減數(shù)分裂后的花粉發(fā)育時期，游??離小孢子發(fā)育并經(jīng)過一次或兩次有絲分裂（ｍｉｔｏｓｉｓ）產(chǎn)生具有營養(yǎng)核和生殖核的成??熟花粉粒（Ｍｃｃｏｒｍｉｃｋ，２００４）。這一過程是通過一系列復雜的步驟進行的，己有研究??報道包括番茄在內許多物種在細胞學水平上的進展。然而，減數(shù)分裂后花粉發(fā)育的??分子機理在很大程度上仍是未知的。??在番茄花藥小孢子發(fā)育的過程中

植物有絲分裂蛋白激酶（ＭＡＰＫ）級聯(lián)途徑參與調控病原相關分子模式（ＰＡ相關分子模式（ＭＡＭＰ）和損傷相關分子模式（ＤＡＭＰ）（引自Ｍｅｎｇ?ａｎｄ１．４?Ｐｌａｎｔ?ｍｉｔｏｇｅｎ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ?ｐｒｏｔｅｉｎ?ｋｉｎａｓｅ?（ＭＡＰＫ）?ｃａｓｃａｄｅｓ?ｉｎ?ｓｅｎ／ｍｉｃｒｏｂｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ?ｍｏｌｅｃｕｌａｒ?ｐａｔｔｅｒｎ?（ＰＡＭＰ／ＭＡＭＰ）?ａｎｄ?ｄａｍａｇｅ－ａｓｌａｒ?ｐａｔｔｅｒｎ?（ＤＡＭＰ）?（Ｍｅｎｊ＊?ａｎｄ?Ｚｈａｎｇ，?２０１３）．??中，ＶＷ／欠和能夠被煙草花葉病毒（ＴＭＶ）激活�；诓《净虺聊夹g，研究發(fā)現(xiàn)ＭＡＰＫＫＫａ－ＮｔＭＥＫ２－ＳＩＰＫ／ＷＩＰＫ－ＷＲＫ導的超敏反應的ＭＡＰＫ級聯(lián)途徑之一（Ｊｉｎ?ｅｗ／．，?２００３）。??■Ｓ／ＭＡＰ／Ｇ、Ｓ／ＭＡＰ尺２和Ｓ／Ｍ４／火３在植物防御生物脅迫中的作用報道（Ｋａｎｄｏｔｈ?ｅｆ?？／．，２００７；?Ｍａｙｒｏｓｅ?ｅｆ?ａ／．，２００４；?Ｓｔｕｌｅｍｅｉｊｅｒ?ｅｆ?ａ／．，

本文編號：2839101