芍藥為芍藥科芍藥屬多年生的宿根草本花卉,是我國古老的名花。其觀賞價值可以與花王牡丹相媲美,有花相之稱,在園林造景中普遍應用。長時間的系統(tǒng)進化形成了芍藥種子獨特的上下胚軸雙重休眠的特征,給芍藥新品種的選育工作帶來很大困難,對芍藥的產業(yè)化發(fā)展十分不利。本研究是以芍藥父本'粉玉樓',母本'粉玉奴'的雜交種子為試驗材料,選取萌發(fā)過程中四個關鍵時期的種子為樣品進行轉錄組測序,篩選出調控芍藥種子萌發(fā)的關鍵基因PlCYP707A1和PlCYP707A2,分析基因表達模式,克隆基因cDNA全長并進行生物信息學分析及植物表達載體構建,為后續(xù)轉化擬南芥的轉基因功能驗證奠定基礎。主要的試驗結果如下:1.分析轉錄組數據,鎖定了脫落酸分解代謝途徑中的調控基因PlCYP707A1和PlCYP707A2為目標基因。以轉錄組測序所得CDS序列為基礎,設計定量引物,通過半定量RT-PCR和實時定量PCR技術分析PlCFP707A1和PlCYP707A2基因的表達量,結果顯示PlCYP707A1基因在吸脹后和下胚軸萌發(fā)時表達量有明顯升高,PlCYP70742基因在芍藥種子萌發(fā)過程中含量逐漸增加�？傮w來說,在芍藥種子萌發(fā)過程中PlCYP707A1和PlCYP707A2基因的表達量升高,對打破休眠起到了促進作用。2.以轉錄組測序所得CDS序列為基礎,設計同源克隆引物,PCR擴增后獲得cDNA全長1407bp,編碼468個氨基酸的PlCYP707A1基因和cDNA全長1392bp,編碼463個氨基酸的PlCYP707A2基因。同時以PlCYP707A1和PlCYP707A2基因的cDNA序列為信息探針,搜索GenBank的基因組或表達序列數據庫,獲得不同物種間的同源基因氨基酸序列,構建進化樹。利用各種在線軟件對PlCYP707A1和PlCYP707A2基因的蛋白質的一級、二級、三級結構和亞細胞初步定位等進行了預測分析。3.利用pBI121植物載體和DNA重組技術構建了 PlCYP707A1和PlCYP707A2基因的表達載體pBI-PlCYP707A1和pBI-PlCYP707A2,接著將其轉化到GV3101型農桿菌制備的感受態(tài)中,為后續(xù)基因轉化擬南芥做功能驗證奠定基礎。
【學位單位】：沈陽農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2017
【中圖分類】：S682.12;Q943.2
【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 文獻綜述
    1.1 芍藥概述
    1.2 種子休眠機理的研究進展
        1.2.1 影響種子休眠的因素
        1.2.2 植物激素GA對種子休眠解除的調控作用
        1.2.3 植物激素ABA對種子休眠解除的調控作用
        1.2.4 其他植物激素對種子休眠解除的調控作用
    1.3 ABA在休眠萌發(fā)過程中的相關調控基因
    1.4 ABA 8'-羥化酶(CYP707As基因)的研究進展
        1.4.1 ABA8'-羥化酶的作用機理
        1.4.2 CYP707As基因(ABA 8'-羥化酶)的表達模式
    1.5 植物表達載體構建的研究進展
    1.6 本研究的目的意義與技術路線
        1.6.1 本研究的目的意義
        1.6.2 本研究的技術路線和內容
第二章 PlCYP707A1和PlCYP707A2基因的表達模式分析
    2.1 試驗材料
    2.2 試驗試劑與儀器
        2.2.1 試驗試劑
        2.2.2 溶液的配制
        2.2.3 試驗儀器
    2.3 試驗方法
        2.3.1 種子的沙藏催芽
        2.3.2 芍藥種子RNA的提取
        2.3.3 RNA質量的檢測
        2.3.4 反轉錄合成cDNA
        2.3.5 半定量RT-PCR分析
        2.3.6 qRT-PCR分析
    2.4 結果與分析
        2.4.1 芍藥種子總RNA的提取質量
        2.4.2 芍藥種子合成的cDNA電泳檢測
        2.4.3 半定量RT-PCR循環(huán)次數的確定
        2.4.4 PlCYP707A1和PlCYP707A2基因的半定量RT-PCR分析
        2.4.5 PlCYP707A1和PlCYP707A2基因的qRT-PCR分析
    2.5 小結
第三章 PlCYP707A1和PlCP707A2基因的克隆與生物信息學分析
    3.1 試驗材料
    3.2 試驗試劑與儀器
        3.2.1 試驗試劑
        3.2.2 菌體及載體
        3.2.3 溶液的配制
        3.2.4 試驗儀器
    3.3 試驗方法
        3.3.1 PlCYP707A1和PlCYP707A2基因的cDNA擴增
        3.3.2 TA克隆
        3.3.3 生物信息學分析工具
    3.4 結果與分析
        3.4.1 PlCYP707A1基因cDNA全長的擴增產物
        3.4.2 PlCYP707A1基因的生物信息學分析
        3.4.3 PlCYP707A2基因cDNA全長的擴增產物
        3.4.4 PlCYP707A2基因的生物信息學分析
    3.5 小結
第四章 PlCYP707A1和PlCYP707A2基因的載體構建及轉化
    4.1 試驗材料
    4.2 試驗試劑與儀器
        4.2.1 試驗試劑
        4.2.2 菌體及載體
        4.2.3 溶液的配制
        4.2.4 試驗儀器
    4.3 試驗方法
        4.3.1 重組質粒PGM-T-CYP707As的提取
        4.3.2 重組質粒PGM-T-CYP707As的雙酶切
        4.3.3 載體質粒pBI121的雙酶切
        4.3.4 目的基因與載體質粒相連
        4.3.5 植物表達載體轉化農桿菌
    4.4 結果與分析
        4.4.1 pBI121-CYP707A1重組載體的菌落PCR鑒定
        4.4.2 pBI121-CYP707A1重組載體的雙酶切驗證
        4.4.3 pBI121-CYP707A2重組載體的菌落PCR鑒定
        4.4.4 pBI121-CYP707A2重組載體的雙酶切驗證
        4.4.5 pBI121-CYP707A1/CYP707A2重組農桿菌菌落PCR鑒定
    4.5 小結
第五章 結論與討論
    5.1 結論
        5.1.1 明確PlCYP707A1和PlCYP707A2基因在芍藥種子萌發(fā)過程中的表達模式
        5.1.2 克隆得到芍藥PlCYP707A1和PlCYP707A2基因
        5.1.3 構建PlCYP707A1和PlCYP707A2基因的植物表達載體并轉化農桿菌
    5.2 討論
參考文獻
致謝

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本文編號：2830349