柑橘風味中的苦味作為其重要的品質(zhì)性狀而備受關(guān)注。類黃酮中的新橘皮糖苷類(Neohesperidoside;NEO)是影響柑橘果實前苦味(‘primary’bitterness)的主要物質(zhì),且其在柑橘果實中的代謝差異一直是近些年的研究熱點。柑橘種屬關(guān)系復雜、突變材料和種質(zhì)資源多樣,豐富的次生代謝差異性使其成為研究類黃酮的理想材料。因此,從生理和分子水平上對柑橘進行種質(zhì)資源評價以及苦味形成機理進行探討具有特殊優(yōu)勢且對產(chǎn)業(yè)發(fā)展意義重大。本研究首先對種植廣泛但不積累NEO的甜橙果實組織進行類黃酮的定性和定量分析,初步研究甜橙中類黃酮的組成以及隨果實發(fā)育的含量變化;其次,克隆不同柑橘種質(zhì)中調(diào)控NEO合成的1,2RhaT(1,2-rhamnosyltransferase gene),分析該基因序列的多態(tài)性與不同種質(zhì)中苦味品質(zhì)產(chǎn)生的相關(guān)性,并利用自然群體和雜交群體提供更多遺傳學依據(jù);最后,探索柚中與NEO代謝有直接競爭關(guān)系的代謝支路,利用基因轉(zhuǎn)化BY2煙草懸浮細胞系對1,2RhaT-like蛋白d GlcT進行功能表征分析,且通過轉(zhuǎn)錄組以及基因表達定量分析數(shù)據(jù)闡明d GlcT和1,2RhaT在柑橘類黃酮代謝中的競爭作用。主要研究結(jié)果如下:1.以兩個紅肉甜橙(‘紅肉’和‘紅暗柳’)和兩個普通果肉甜橙(‘清家’和‘暗柳’)不同發(fā)育期果實四個組織(黃皮層、白皮層、囊衣和汁胞)為材料,通過液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)法結(jié)合添加內(nèi)標實驗,初步鑒定了甜橙果實各組織中黃烷酮糖苷和聚甲氧基黃酮的組成,并利用液相色譜(HPLC)法進行定量分析。結(jié)果顯示,甜橙各組織中所檢測的四種黃烷酮糖苷類均屬于蕓香糖苷類(Rutinoside;RUT),與NEO的前體物質(zhì)相同,但并不具有苦味,表明甜橙在NEO代謝上并沒有遺傳柚的性狀;對甜橙中Cs1,2RhaT-like基因進行克隆分析,發(fā)現(xiàn)一條與Cm1,2RhaT(Gen Bank accession:AY048882)核苷酸序列同源性為92%的候選基因,但其編碼區(qū)出現(xiàn)兩處單堿基缺失,此基因的移碼突變可能是導致甜橙中類黃酮NEO無法合成的直接原因。2.對柑橘各種屬不同栽培種中1,2RhaT基因及其高度同源序列進行克隆,并結(jié)合柑橘基因組數(shù)據(jù)庫進行比對分析,發(fā)現(xiàn)柑橘基因組中擁有兩類與Cm1,2RhaT高度同源且被注釋作為1,2RhaT-like的基因。一類具有豐富的序列多態(tài)性(命名為d GlcT-1),其編碼的氨基酸序列與Cm1,2RhaT同源性高達88%,且僅在個別柚種質(zhì)中能擴增到完整的編碼區(qū)序列;另一類則包括兩個基因(命名為d GlcT-2和d GlcT-3),其編碼的氨基酸序列與Cm1,2RhaT同源性均為67%,且以串聯(lián)復制的方式廣泛分布在各柑橘種質(zhì)的基因組中。3.對分屬柑橘屬、枳屬和金柑屬的50個柑橘栽培種進行1,2RhaT及1,2RhaT-like(d GlcT-1,d GlcT-2和d GlcT-3)基因型與柚皮苷積累表現(xiàn)型的關(guān)聯(lián)分析,發(fā)現(xiàn)僅1,2RhaT與枳屬和柑橘屬果實中柚皮苷的積累直接相關(guān)。此外,通過紅橘×枳殼以及HB柚×Fairchild雜交群體分析表明,含完整1,2RhaT序列的雜交子代(對比Cm1,2RhaT,AY048882;NCBI)果實能正常合成柚皮苷,相反則不能,進一步證明1,2RhaT對柑橘屬和枳屬中柚皮苷的合成具有重要作用。值得關(guān)注的是,盡管具有完整的1,2RhaT序列,但金柑屬各種質(zhì)中依然無法積累柚皮苷或者黃烷酮糖苷類,且將鳳凰柚中的Cm1,2RhaT轉(zhuǎn)化山金柑后依然無法檢測到柚皮苷的產(chǎn)生,預示著金柑屬中橘皮糖苷類的代謝缺失并非由1,2RhaT所致。4.研究結(jié)果同時表明,1,2RhaT-like基因與柑橘中NEO的產(chǎn)生并無直接關(guān)聯(lián)性。因此,通過基因轉(zhuǎn)化煙草BY2懸浮細胞體系對Cmd GlcT-1,Csd GlcT-2以及Cm1,2RhaT進行了功能驗證及功能差異分析。結(jié)果顯示,d GlcT-1和d GlcT-2是一個底物廣泛的類黃酮-7-O-二-葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶,最優(yōu)底物是黃烷酮-7-O-葡萄糖苷;d GlcT不具有1,2RhaT功能且無法催化NEO的形成,但是其催化產(chǎn)物與類黃酮NEO可共用黃烷酮/黃酮-7-O-葡萄糖苷作為直接前體,兩者間可能存在直接的底物競爭關(guān)系。但是,雖然有功能,d GlcT的代謝產(chǎn)物在果實整個發(fā)育期內(nèi)含量均極低,轉(zhuǎn)錄組和基因表達定量分析結(jié)果表明在果實發(fā)育初期,NEO或者RUT對底物的強烈競爭導致其代謝受阻;隨著果實的成熟,流向類黃酮代謝底物的供應不足可能是類黃酮-7-O-二-葡萄糖苷乃至整個類黃酮糖苷類代謝受阻的主要原因。通過對柑橘NEO特別是柚皮苷代謝積累機理的研究,為揭示柑橘前苦味形成機制奠定了理論基礎。而d GlcT的發(fā)現(xiàn),對間接改變柚果實中NEO的積累進而改善果實苦味有著重大意義。
【學位單位】：華中農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2017
【中圖分類】：S666
【部分圖文】：

華中農(nóng)業(yè)大學 2017 屆博士研究生學位論文以及減少類黃酮的化學毒性等（Vogt and Jones 2000, Brenda 2001, Bowles et al 2005Koes et al 2005）。植物中的類黃酮糖苷類主要分為兩類：一類是將糖分子以C-C鍵直接連接于類黃酮糖苷配基上或者以O-linked的方式連接于類黃酮糖苷配基的羥基上的單糖苷轉(zhuǎn)移酶類；另一類則是催化在原有糖苷鍵上繼續(xù)連接糖分子的多糖苷轉(zhuǎn)移酶類（Jones and Vogt 2001, Masada et al 2009, Vukics and Guttman 2010, Nagatomo et a2014）。在植物中，用于糖基化反應的糖分子主要是葡萄糖和鼠李糖，而阿拉伯糖、木糖以及葡萄糖醛酸則所用較少（Jay et al 2006, Williams 2006）。據(jù)不完全統(tǒng)計，目前柑橘中已確定的生物類黃酮已超過80種，分屬黃烷酮、黃酮、黃酮醇、黃烷醇和花青素幾類（表 1-1；圖 1-1）（陳嘉景等 2016）。且以黃烷酮-O-糖苷類、黃酮-O糖苷類和黃酮-C-糖苷類含量最為豐富（Gattuso et al 2007,Abad-Garcia 2014）。

圖 1-2 柑橘中黃烷酮糖苷類的代謝柑橘中苯丙烷代謝途徑（A）和主要的黃烷酮糖苷類代謝途徑（B）(參考自 Frydman et al 2004,Owens et al 2011, Chen et al 2015c)。PAL，苯丙氨酸解氨酶；C4H，肉桂酸 4-羥化酶；4CL，4-香豆酰輔酶 A 連接酶；CHS，查爾酮合成酶；CHI，查爾酮異構(gòu)酶；7-GlcT，黃烷酮 7-O-葡萄糖轉(zhuǎn)移酶；1,2RhaT，1,2 鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶；1,6RhaT，1,6-鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶。Fig. 1-2 Metabolic pathways of flavanone glycosides in citrusMetabolic pathways of phenylpropanoid (A) and predominant flavanone glycosides (B) in citrus(modified from Frydman et al. 2004, Owens et al. 2011, Chen et al. 2015c). PAL, phenylalaninammonia-lyase; C4H, cinnamate-4-hydroxylase; 4CL, 4-coumarate:coenzyme A ligase; CHS, chalconesynthase; CHI, chalcone isomerase; F3'H, flavanone 3'-hydroxylase; 7-GlcT, flavanone7-O-glucosyltransferase; 1,2RhaT, 1,2-rhamnosyltransferase; 1,6RhaT, 1,6-rhamnosyltransferase.黃烷酮糖苷類大量存在于柑橘屬的果實中且以白皮層和囊衣中的含量最高，而在黃皮層和汁胞中的含量較低（Nogata et al 2006, Zhang et al 2014b）。另外，在葉片、花、皮、根等部位也有少量的積累（Lim 2012）。黃烷酮類在柑橘果實中的代謝存在

圖 1-3 柑橘中主要的二氫黃酮醇類（A）、花青苷類（B）和黃酮醇類（C）代謝途徑參考自 Piero et al 2006，Gou et al 2011，Lo Piero 2015。F3H，黃烷酮-3-羥化酶；F3’H，類黃酮-3’-羥化酶；F3’5’H，類黃酮-3’5’-羥化酶；DFR，二氫黃酮醇還原酶；ANS，花青素合成酶；3-Glct，黃酮醇 3-葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶；UGTs，UDP 依賴的糖苷轉(zhuǎn)移酶類；ATT，�；D(zhuǎn)移酶類；FLS，黃酮醇合成酶；OMT，O-甲基化轉(zhuǎn)移酶；1,6Rhat，1,6-鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶。Fig. 1-3 Metabolic pathways of predominant dihydroflavonols (A), anthocyanins (B) andflavonols (C) in citrusModified from Piero et al. 2006, Gou et al 2011, Piero 2015. F3H, flavanone-3-hydroxylase; F3'H,flavonoids-3'-hydroxylase; F3'5'H, flavonoid-3',5'-hydroxylase; DFR, dihydroflavanol-4-reductase;ANS, anthocyanidin synthase; 3-Glat, flavonol-3-O-glucosyltransferase; UGTs,UDP-Glycosyltransferases; ATT, acyltransferases; FLS, flavonol synthase; OMT, O-methyltransferase;1,6Rhat, 1,6-rhamnosyltransferas.FLS 通過催化三種黃烷醇代謝前體分別形成山奈酚、槲皮素和楊梅素而參與到

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本文編號：2814900