發(fā)布時間：2020-08-31 21:05

　　 多肽信號對于細胞間交流具有重要作用,許多多肽作為激素參與了植物各種生長發(fā)育過程以及環(huán)境響應�？焖賶A化因子(RALF)就是植物多肽家族中的一類。RALF多肽激素參與了多種生理過程,比如:根系伸長、植物-微生物互作以及花粉發(fā)育、授粉受精等。不同物種間RALF基因數(shù)量和功能多樣,而在番茄(Solanum lycopersicum)中RALF基因的功能尚不清楚。目前對于RALF多肽的研究主要集中在生長發(fā)育方面,但在環(huán)境脅迫中的作用尚不清楚。本文鑒定了番茄中具有保守結構的RALF基因,利用GUS報告基因研究其轉錄表達模式,并利用病毒誘導基因沉默技術(VIGS)探究了 RALF在番茄生長發(fā)育和低溫抗性中的功能。主要研究結果如下:1.鑒定了番茄的RALF基因,發(fā)現(xiàn)RALF4基因對于調(diào)控根系發(fā)育具有重要功能。利用系統(tǒng)進化樹分析番茄中SlRALR基因與擬南芥中AtRALF基因的同源性,并且根據(jù)RALF的保守結構特點篩選出4個RALF基因。測定了它們在不同器官組織中的表達模式,推測RALF可能參與了不同器官的發(fā)育。RALF4主要在莖、葉、花中表達,而在根中表達量遠低于其他基因;RALF5主要在根和花中表達,尤其以根中表達最為明顯;RALFR主要在根、莖、葉、花中表達;RALF7主要在葉中表達,而在根中表達量和RALF4一樣低。利用VIGS技術將RALR4、RALF5、RRAL6、RALF7基因沉默,研究發(fā)現(xiàn),與對照TRV植株相比,RALF4沉默植株生長明顯矮化,而RALF5沉默植株生長得到促進,RALF6、RALFR沉默植株則無明顯差異。結果表明,盡管RALF4、RALF5、RALF6同源性高,但是其功能出現(xiàn)分化。單獨將RALFR沉默植株與TRV植株比較,RALF4沉默植株的根系發(fā)育受到嚴重抑制,而RALFR在根系中表達量卻很低,表明RALF4可能在根系的特定發(fā)育階段發(fā)揮作用。以上結果表明,RALF5抑制植物生長,而RALF4對于根系的發(fā)育具有重要作用。2.明確了RALF4基因在根中的表達模式以及RALF4多肽并不通過影響生長素信號調(diào)控側根發(fā)育。發(fā)現(xiàn)在低濃度RALF處理下,RALF4對于根伸長的抑制作用不明顯,但是其仍具有RALF多肽處理幼苗提高培養(yǎng)基pH的生理活性。在轉基因植株pRALF4::GUS中,發(fā)現(xiàn)RALF4基因在根中的表達具有特異性,其主要在側根原基以及側根的基部表達,表明RALF4可能并不參與主根的發(fā)育,而是影響側根的生長。生長素是根系發(fā)育最主要的激素,發(fā)現(xiàn)沉默RALF4導致根尖生長素響應增強,生長素合成增加。但外源處理RALF4之后,并沒有改變根中生長素的響應。同時,對pRALF4::GUS外源處理NAA,發(fā)現(xiàn)生長素雖然能夠促進側根發(fā)生但卻并不能誘導促進RALF4的表達。利用CRISPR/Cas9技術構建了ralf4缺失突變體,進一步明確了 RALF4在側根發(fā)育中的作用。因此,RALFR缺失導致根系發(fā)育受阻,其調(diào)控過程可能與生長素信號相互獨立。基于RALFR GUS染色的情況,其可能在側根突破表皮的過程中發(fā)揮作用。3.明確了 RALF5對于低溫抗性的負調(diào)控作用。RALF4、RALF5、RALF6的表達量水平在低溫脅迫下先上調(diào)后下調(diào);利用VIGS技術沉默RALF4、RRAL5、RALF6三個基因,并對沉默植株進行低溫處理,發(fā)現(xiàn)目的基因沉默植株抗性較對照TRV植株增強,又以RALF5沉默植株的抗性最好。測定了沉默植株中CBF抗冷途徑中CBF1和COR47的基因表達,發(fā)現(xiàn)RALF5沉默植株的基因表達水平顯著上調(diào)且CBF1上調(diào)最多;同樣RALF5沉默植株ABA含量積累最多,并顯著高于對照TRV植株,并且這種積累與ABA合成基因NCED1表達水平的提高相關;已有研究表明,BR信號的轉錄因子BZR1能夠調(diào)控CBf1/2基因,從而提高植物低溫抗性。RALF5沉默植株中,BR合成基因DET2也明顯上調(diào),表明BR也可能參與了低溫抗性的過程。以上實驗表明RALF5負調(diào)控植物低溫抗性。
【學位單位】：浙江大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：S641.2
【部分圖文】：

浙江大學碩士學位論文邐逡逑于發(fā)芽的番茄種子，會導致胚根的伸長受到顯著停滯。在擬南芥中也觀察到類似逡逑現(xiàn)象。過表達兄不僅抑制主根的細胞伸長，而且降低側根密度。兄４ＬＦ７基逡逑因敲除植株則在主根生長和側根密度方面，表現(xiàn)出與過表達植株相反的表型。因逡逑此，ＲＡＬＦｓ多肽在根生長發(fā)育中發(fā)揮關鍵的調(diào)節(jié)作用。逡逑（Ａ）邐（Ｂ）逡逑

邐）逡逑Ｃｅｌｌ邋ｅｔｏｎｇａｔｉｏｎ逡逑圖１．１邋ＲＡＬＦ參與的植物中生長發(fā)育（Ｍｕｒｐｈｙ邋ｅｔａｌ，邋２０１４）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．１邋ＲＡＬＦ邋ｉｎ邋ｐｌａｎｔ邋ｇｒｏｗｔｈ邋ａｎｄ邋ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ邋（Ｍｕｑ？ｈｙ邋ｅｔ邋ａｌ，邋２０１４）逡逑ＲＡＬＦ多肽對子葉下胚軸的伸長也存在抑制作用。在多肽ＲＡＬＦｌ存在的情逡逑況下，黑暗中萌發(fā)的擬南芥幼苗下胚軸伸長受到抑制。當幼苗重新在正常培養(yǎng)基逡逑上生長時，下胚軸伸長恢復（Ｍｉｎｇｏｓｓｉｅｔａｌ，２０１０）。人工合成的ＲＡＬＦ１９，２２，２３，逡逑２４，邋３１，３３和３４，或過表達Ａｔ／Ｌ４ＬＦ八也對下胚軸伸長具有抑制作用。但是，逡逑ＲＡＬＦ４對下胚軸或主根的細胞伸長沒有任何影響（Ｅｖａｎｅｔａｌ，２０１４）。這些觀察逡逑－結果有力地支持了邋ＲＡＬＦ抑制擬南芥生長和發(fā)育過程中細胞伸長的假設。逡逑與兄４ＬＦ７的過表達相似，／＾Ｚ＜Ｆ２３過表達植株表現(xiàn)出生長減弱、矮化、分枝逡逑增加的表型（Ｂｅｒｇｏｎｃｉｅｔａｌ，２０１４）。值得注意的是，在蕓苔素內(nèi)酯（ＢＲ）存在逡逑的情況下

邐Ｐｏｌｌｅｎ邋ｔｕｂ＾＾逡逑Ｆｅｍａｌｅ邋ｇａｍｅｔｏｐｈｙｔｅ逡逑圖１，２邋ＲＡＬＦ－ＦＥＲ在植物生長發(fā)育中的信號轉導（Ｃｈｒｉｓｔｉｎａ邋ｅｔａｌ，邋２０１８）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．２邋ＲＡＬＦ－ＦＥＲ－ｍｅｄｉａｔｅｄ邋ｓｉｇｎａｌｉｎｇ邋ｉｎ邋ｐｌａｎｔ邋ｇｒｏｗｔｈ邋ａｎｄ邋ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ逡逑（Ｃｈｒｉｓｔｉｎａ邋ｅｔ邋ａｌ，邋２０１８）逡逑１．１．４邋ＲＡＬＦ及其受體ＦＥＲ在植物生物和非生物脅迫中的功能逡逑ＲＡＬＦｓ在生物和非生物脅迫中的作用主要依賴于其受體激酶ＦＥＲ實現(xiàn)。而逡逑在不同的脅迫響應中，ＲＡＬＦｓ具有不同的作用以及分子機制。有研究表明，ＦＥＲ逡逑直接參與植物的先天免疫。ＦＥＲ作為支架蛋白能夠促進病原體相關分子模式逡逑（ＰＡＭＰ）受體ＦＬＳ２或ＥＦＲ與ＢＡＫ１結合以分別響應ｆｌｇ２２和ｅｌｆｌ８兩種ＰＡＭＰ，逡逑從而正調(diào)控植物防御。但是處理多肽ＲＡＬＦ２３之后，抑制了邋ＦＬＳ２／ＥＦＲ－ＢＡＫ１復逡逑合體的形成，并阻斷了邋ＲＯＳ爆發(fā)等免疫反應（Ｓｔｅｇｍａｎｎｅｔａｌ，２０１７）。但是逡逑突變體則對ＲＡＬＦ多肽抑制先天免疫反應不敏感，說明與ＲＡＬＦ１邋—樣，成熟逡逑ＲＡＬＦ２３多肽的形成需要經(jīng)歷前體ＲＡＬＦ分泌，以及后續(xù)Ｓ１Ｐ加工，切割后的成逡逑熟多肽與ＦＥＲ的胞外域結合

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6 ;真色彩 真性情——訪盛威科油墨亞洲區(qū)總裁RALF及盛威科(上海)油墨有限公司董事總經(jīng)理司俊芳[J];印刷技術;2009年12期

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本文編號：2809321