【摘要】：菊花(Chrysanthemum morifolium Ramat)是極具觀賞價值的園藝作物,花色是其重要經(jīng)濟性狀指標�；ㄇ嘬帐羌t色系菊花的主要色素,其合成受外界環(huán)境和自身遺傳調(diào)控。前人研究表明,MYB和bHLH轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控多種植物花青苷代謝,然而菊花花青苷代謝調(diào)控關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子及調(diào)控機理仍不十分明晰。本文在前期鑒別出調(diào)控花青苷代謝激活型CmMYB6成員基礎(chǔ)上,以不同顏色早小菊‘Z1'(深紅色)、‘Z2'(粉色)、‘Z3'(黃色)、白色切花菊‘Jimba’(WJ)和變紅‘Jimba’(TRJ)為材料,分離鑒別了參與菊花花青苷代謝轉(zhuǎn)錄調(diào)控的關(guān)鍵成員CmbHLH2,以及參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控TRJ花青苷代謝的抑制型成員CmMYB#7。主要研究結(jié)果如下:1、鑒別菊花花青苷代謝關(guān)鍵CmbHLH2轉(zhuǎn)錄因子。利用菊花EST數(shù)據(jù)庫,通過進化分析和序列比對分離得到參與菊花花青苷代謝的bHLH轉(zhuǎn)錄因子CmbHLH2,其表達在三種不同色系早小菊'Z1'、'Z2’和'Z3'中與花青苷代謝結(jié)構(gòu)基因表達呈正相關(guān)。啟動子誘導(dǎo)實驗結(jié)果表明,CmbHLH2能與CmMYB6協(xié)同激活CmDFR啟動子。酵母雜交實驗表明,CmbHLH2和CmMYB6均能結(jié)合CmDFR啟動子序列,且CmbHLH2可與CmMYB6發(fā)生蛋白互作形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合體。瞬時過表達CmbHLH2和CmMYB6能誘導(dǎo)煙草葉片花青苷累積。2、篩選獲得菊花花青苷代謝相關(guān)MYB轉(zhuǎn)錄因子家族成員。利用轉(zhuǎn)錄組測序,克隆獲得91個在‘Jimba'菊花花瓣中表達的MYBs轉(zhuǎn)錄因子家族成員。分析了WJ和TRJ中差異表達的MYBs轉(zhuǎn)錄因子,從中篩選出表達差異倍數(shù)大于4的MYBs,其中,CmMYB#17、CmMYB#16、CmMYB#39和CmMYB#85在 TRJ 中的表達高于WJ;CmMYB#7和CmMYB#15在TRJ中的表達低于WJ。分析這6個MYBs轉(zhuǎn)錄因子在TRJ三種不同著色程度花瓣(內(nèi)層白色花瓣、中層尖紅花瓣、外層全紅花瓣)中的表達模式發(fā)現(xiàn),除CmMYB#39外,CmMYB#17、CmMYB#16 CmMYB#39和CmMYB#85表達與花青苷合成結(jié)構(gòu)基因表達呈正相關(guān)。CmMYB#7和CmMYB#15的表達與花青苷合成結(jié)構(gòu)基因表達呈負相關(guān)。將這5個轉(zhuǎn)錄因子作為參與花青苷代謝調(diào)控研究的候選MYBs。3、闡明了 R3型MYB抑制子CmMYB#7調(diào)控菊花花青苷代謝分子機制。對上述 5 個候選 MYBs CmMYB#17、CmMYB#16、CmMYB#85、CmMYB#7 和CmMYB#15進行啟動子誘導(dǎo)效應(yīng)分析,結(jié)果表明,它們均不能單獨激活或抑制花青苷合成結(jié)構(gòu)基因CmDFR和CmUFGT啟動子,當與CmMYB6和CmbHLH2混合時,CmMYB#7可抑制CmMYB6-CmbHLH2復(fù)合體對結(jié)構(gòu)基因CmDFR和CmUFGT啟動子的激活效應(yīng)。酵母雙雜交實驗、定點突變實驗及熒光素酶互補成像實驗結(jié)果表明,CmMYB#7通過與CmbHLH2的競爭結(jié)合,從而抑制CmMYB6-CmbHLH2復(fù)合體對花青苷結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)。綜上所述,本研究鑒別得到了 1個參與菊花花青苷代謝的bHLH轉(zhuǎn)錄因子,即CmbHLH2,可與花青苷激活子CmMYB6協(xié)同增強花青苷合成結(jié)構(gòu)基因CmDFR啟動子轉(zhuǎn)錄活性,進而促進花青苷合成;鑒別獲得了 1個R3型花青苷抑制子CmMYB#7,可與CmMYB6競爭結(jié)合CmbHLH2抑制菊花花青苷合成結(jié)構(gòu)基因CmDFR和CmUFGT啟動子轉(zhuǎn)錄活性,參與TRJ花青苷代謝轉(zhuǎn)錄調(diào)控。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S682.11
【圖文】：

２０１４）進行全長克隆。逡逑進化分析結(jié)果表明，與已報道花青苷合成Ｉｌｌｆ亞族ｂＨＬＨｓ聚類到逡逑同一分支（圖２．１Ｂ），ＣｍｂＨＬＨ２與大麗花ＤｖｌＶＳ氨基酸序列相似度為６４％，ＤｖＪＦＳ逡逑已報道參與大麗花花青苷合成（Ｏｈｎｏ等，２０１１）。其與擬南芥ＴＴ８氨基酸序列逡逑相似度達５９％，ＴＴ８能與擬南芥ＭＹＢ轉(zhuǎn)錄因子ＰＡＰ１結(jié)合形成復(fù)合體調(diào)控花青逡逑苷合成（Ｄｕｂｏｓ等，２０１０）。ＣｍｂＨＬＨｌ則聚類到其他分支。逡逑結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果表明，ＣｍｂＨＬＨｌ和ＣｍｂＨＬＨ２包含一個螺旋－環(huán)－螺旋結(jié)構(gòu)逡逑１７逡逑

三個品種早小菊‘ｚｒ，邋ｆＺ２’和‘Ｚ３’分別呈深紅色、粉紅色和黃色（圖逡逑２．２Ａ）�；ò昕偦ㄇ嘬蘸窟M行測定結(jié)果，Ｚ１’花青苷含量為２．８３邋ｍｇ／ｇＦＷ，‘Ｚ２’逡逑花青苷含量為０．０８ｍｇ／ｇＦＷ，‘Ｚ３’中檢測不到花青苷（圖２．２Ｂ）。結(jié)果表明，花逡逑青苷含量差異是三個早小菊品種花色差異的原因之一。逡逑２０逡

ｐｌａｎｔ邋ｃａｒｅ在線軟件分析啟動子順式作用元件發(fā)現(xiàn)，啟動子區(qū)域包含ＭＹＢ結(jié)合元逡逑件ＭＢＳ邋（ＭＹＢ邋ｂｉｎｄｉｎｇ邋ｓｉｔｅ），及真核生物轉(zhuǎn)錄起始ＲＮＡ聚合酶結(jié)合位點ＴＡＴＡ逡逑盒，另外還包含一些響應(yīng)光調(diào)控的順式作用元件（圖２．４）。逡逑ＴＡＴＡ逡逑邐▲邋■邋▲邋■邋■邐？—逡逑－７６９邋ｂｐ邐－８０邋ｂｐ逡逑圖２．４邋ＣｍＤ／Ｗ啟動子順式作用元件分析逡逑圓形表示ＴＡＴＡ盒，三角形表示ＭＹＢ識別元件，正方形表示ｂＨＬＨ識別元件。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２．４邋Ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｏｆ邋ｃｉｓ－ｅｌｅｍｅｎｔｓ邋ｏｎ邋ｔｈｅ邋ｐｒｏｍｏｔｅｒ邋ｏｆ邋ＣｍＤＦＲ逡逑Ｃｉｒｃｌｅ邋ｍｅａｎｓ邋ＴＡＴＡ邋ｂｏｘ，邋ｔｒｉａｎｇｌｅｓ邋ｍｅａｎｓ邋ＭＹＢ邋ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ邋ｃｉｓ－ｅｌｅｍｅｎｔｓ，邋ｓｑｕａｒｅｓ邋ｍｅａｎｓ邋ｂＨＬＨ逡逑ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ邋ｃｉｓ－ｅｌｅｍｅｎｔｓ．逡逑２．２．５邐ＣｍｂＨＬＨ２協(xié)同ＣｍＭＹＢ６結(jié)構(gòu)基因ＯｗＤ／７？啟動子逡逑為進一步研究ＣｗＷｉＺＪ／７和功能，將其分別構(gòu)建到ｐＧｒｅｅｎｌｌ邋００２９逡逑６２－ＳＫ表達載體，將ＯｍＤＦＴ？啟動子構(gòu)建到ｐＧｒｅｅｎｌｌ邋０８００－ＬＵＣ載體，利用雙僁逡逑光素酶實驗體系分析轉(zhuǎn)錄因子對啟動子是否存在調(diào)控作用。將和逡逑單獨或混合注射本氏煙草，結(jié)果表明Ｃｗ和逡逑均不能單獨激活或抑制結(jié)構(gòu)基因ＣｗＤＦ／？啟動子。當與花青苷激活子逡逑（Ｌｉｕ等，２０１５邋）混合后，能顯著增強Ｃ／ＷＭ７５６對ＣｗＤＦｉ？啟動子激逡逑活效應(yīng)

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 葛翠蓮;黃春輝;徐小彪;;果實花青素生物合成研究進展[J];園藝學(xué)報;2012年09期

2 戴燦;苗聰秀;盧光t;;基于重疊延伸PCR法的定點突變技術(shù)[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展;2010年03期

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本文編號：2803549