【摘要】：草莓(Fragaria × ananassa Duch.)屬于薔薇科草莓屬多年生草本植物,為世界范圍內(nèi)廣泛栽培、多用于鮮食的水果。其果實因富含營養(yǎng)物質(zhì)(如維生素C,維生素A,花青素等),風(fēng)味獨特、香甜,以及顏色鮮艷受到廣大消費者的喜愛�；ㄇ嗨夭粌H是一種重要的抗氧化物質(zhì),對人體有重要的保健功能,而且是草莓果實顏色形成的主要原因,是評判果實外觀品質(zhì)的核心指標,直接影響著果實的商品價值。因此,增加果實中花青素的含量,成為了草莓育種者和栽培者追求的目標。自然界中不同顏色草莓果實尤其是淺色(如黃、白色)材料的存在,為探索草莓果實花青素積累機制提供了良好機會,并在研究中得到了應(yīng)用,但都局限于野生二倍體森林草莓或五葉草莓中,且大都集中于對已知的花青素合成和調(diào)控相關(guān)基因或轉(zhuǎn)錄因子的研究,而對栽培的八倍體草莓花青素合成與調(diào)控的研究甚少、尤其是在草莓自身的花青素合成與調(diào)控的新基因挖掘方面的研究還鮮見報道。本研究選用遺傳背景一致的紅肉('紅顏')和白肉('小白')八倍體栽培草莓,利用組學(xué)、生物信息學(xué)以及基因功能驗證對草莓中花青素的調(diào)控關(guān)鍵和網(wǎng)絡(luò)進行了研究。主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:1.采用高效液相色譜(High-performance liquid chromatography,HPLC)方法測定八倍體紅肉草莓'紅顏'和白肉草莓'小白'5個發(fā)育成熟階段果實表皮和果肉中兩種主要花青素苷(天竺葵3葡萄糖苷:Pelargonidin 3-glucoside,Pg3G和矢車菊素3葡萄糖苷:Cyanidin 3-glucoside,Cy3G)含量變化。結(jié)果顯示,'紅顏'果實果肉中僅有Pg3G積累,且其含量隨著果實發(fā)育成熟過程逐漸增加;'小白'果實果肉中無花青素苷積累。'紅顏'和'小白'果實表皮中Pg3G和Cy3G均有積累,其中Pg3G含量約為Cy3G的2-3倍,且'紅顏'果實表皮中花青素苷含量高于'小白'果實表皮中的含量。2.利用同源克隆方法從'小白'草莓果實中克隆出花青素苷合成酶(Anthocyanin synthase,ANS)基因 并采用實時定量(Real-time quantitative PCR,qPCR)方法對其在'紅顏'和'小白'果實中的表達量進行測定,然后通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法,在'小白'果實中瞬時過表達FaANS對其進行功能分析表明,FaANS在'小白'果實果肉中表達水平遠低于其在'紅顏'果實果肉中的表達量,并且過表達FaANS后的'小白'果實較對照無明顯的表型變化,表明過表達FaANS不能恢復(fù)'小白'果實中花青素苷的積累。3.利用RNA測序(RNA sequencing,RNAseq)技術(shù)對'小白’和'紅顏'白果和全紅期果實果肉進行高通量深度轉(zhuǎn)錄組測序,并對其花青素苷合成相關(guān)基因和調(diào)控因子的表達模式進行分析發(fā)現(xiàn),與'紅顏'相比,幾乎所有花青素苷合成途徑中關(guān)鍵酶基因(CHS、CHI、F3H、DFR、ANS和UFGT)的表達水平在'小白'中均受到抑制,而F3'H由于其在'小白'和'紅顏'中的表達量極低,在兩個品種草莓中的表達水平無明顯差異。轉(zhuǎn)錄因子MYB1R在'小白’中上調(diào),WD40在'小白'中顯著下調(diào)。4.利用HPLC方法對'紅顏'和'小白'果實發(fā)育過程中的抗壞血酸(Ascorbicacid,AsA)進行測定發(fā)現(xiàn),高花青素苷含量的'紅顏'含有高AsA水平。并基于RNAseq數(shù)據(jù),利用生物信息學(xué)方法對其代謝通路基因表達進行分析發(fā)現(xiàn),這種差異主要是通過對D-葡萄糖醛酸途徑的調(diào)控造成。在'小白'中,該途徑中關(guān)鍵酶基因PME、PG以及GalUR的表達水平均較其在'紅顏'中的表達量顯著下降。此外,與'紅顏'中的表達水平相比,'小白'中蔗糖合成關(guān)鍵基因表達也受到抑制,但生長素、赤霉素以及乙烯信號途徑中的關(guān)鍵基因(如AUX/IAA、GA20ox、ERF等)的表達均有所增強。5.基于RNAseq數(shù)據(jù),利用生物信息學(xué)方法對草莓中花青素苷相關(guān)的長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNAs,lncRNAs)進行篩選鑒定發(fā)現(xiàn),草莓中有50,601個轉(zhuǎn)錄本為可能的lncRNAs。與'紅顏'相比,'小白'中分別有19個和12個lncRNAs在白果期顯著下調(diào)或上調(diào);49個和20個lncRNAs在紅果期顯著下調(diào)或上調(diào),6個lncRNAs在紅果和白果時期均下調(diào)以及4個lncRNAs在紅果和白果時期均上調(diào)。對草莓中已知的小RNA(microRNA,miRNA)進行前體及靶基因預(yù)測發(fā)現(xiàn),130個lncRNAs可能作為80個miRNAs的前體,其中僅有1個lncRNA在'小白’和'紅顏'中的表達水平存在差異;392個miRNAs靶向60個差異表達的lncRNAs,說明lncRNAs主要是通過作為miRNAs的靶基因參與花青素苷的調(diào)控。通過lncRNAs及miRNAs前體與靶基因互作構(gòu)建了 lncRNAs參與草莓花青素苷的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。6.通過同源克隆方法從草莓果實中克隆出FaMYB1O基因,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法在'小白'和'紅顏'果實中進行過量表達FaMYB10發(fā)現(xiàn),過表達FaMYB10后的'小白’果實表型發(fā)生明顯變化,由白色果肉變?yōu)榧t色果肉;在過表達FaMYB10后的'紅顏’果實中,果實表皮和果肉的顏色均較對照變深。利用HPLC方法測定表明,FaMYB10過表達后的'小白'和'紅顏'果肉中均恢復(fù)了 Cy3G的積累,而在果實表皮中Cy3G含量較對照明顯增加。利用qPCR方法對過表達FaMYB10的'小白'果實果肉中花青素苷相關(guān)基因及調(diào)控因子表達水平進行檢測表明,在過表達果實中花青素苷合成關(guān)鍵基因CHS、CHI、DFR、F3’H、ANS和UFGT表達量均顯著上升,其中F3’H基因在正常生長條件下的'紅顏’和'小白’中幾乎不表達,但在過表達果實中其表達量顯著增加,說明FaMYB10可能對其表達進行調(diào)控,從而使過表達果實中花青素苷Cy3G恢復(fù)積累。
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S668.4
【圖文】：

花青素苷屬于植物次生代謝過程中產(chǎn)生的一種類黃酮化合物，其基本結(jié)構(gòu)為Ｃ６－Ｃ３－逡逑Ｃ６，是多羥基或多酰基糖苷，２－苯基苯并吡喃的衍生物。目前，已有近７００種花青素苷逡逑在植物中被發(fā)現(xiàn)［１４］，根據(jù)其取代基的不同位置主要分為６大類（圖１－１）：天竺葵素逡逑（Ｐｅｌａｒｇｏｎｉｄｉｎ，Ｐｇ）、矢車菊素（Ｃｙａｎｉｄｉｎ，Ｃｙ）、飛燕草素（Ｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎ，邋Ｄｐ）、茍藥素逡逑（Ｐｅｏｎｉｄｉｎ，邋Ｐｎ）、矮牽牛素（Ｐｅｔｕｎｉｄｉｎ，Ｐｔ）以及錦葵素（Ｍａｌｖｉｄｉｎ，Ｍｖ）邋［１５，１６］。至今，逡逑許多研宄利用液質(zhì)聯(lián)用（ＨＰＬＣ－ＭＳ）和高效液相色譜（ＨＰＬＣ－ＤＡ）技術(shù)從草莓中已分逡逑離鑒定出多種花青素苷，比如天竺葵素或矢車菊素３－蕓香苷（？６１３租0１１丨（１丨１１／＃荊蓿保背兀保保常

本文編號：2779404