【摘要】：開花是植物從營養(yǎng)生長到生殖生長的重要轉(zhuǎn)變,是植物生長發(fā)育的核心環(huán)節(jié)。這一質(zhì)變過程受到內(nèi)源激素和環(huán)境信號的共同調(diào)控,研究開花時間的調(diào)控機理對蔬菜作物的生產(chǎn)和育種具有重要的經(jīng)濟價值。目前通過對擬南芥開花途徑的深入研究,已確認了六條開花途徑。開花相關基因構成了復雜的調(diào)控網(wǎng)絡,不同的開花途徑交匯并激活“開花響應元件”,FT基因就是“開花響應元件”之一。本研究對不結(jié)球白菜BcMAF2的低溫應答機制進行了探索,并通過酵母雙雜交技術篩選與BcFT互作的蛋白。主要研究結(jié)果如下:1.不結(jié)球白菜'蘇州青'BcMAF 基因編碼一個192氨基酸分子的蛋白質(zhì),分子量為21.5×103Da,等電點為6.22,無跨膜區(qū)域。BcMAF2蛋白質(zhì)的N端1～60氨基酸之間含有一個保守的MADS-box結(jié)構域,屬于MADS-box蛋白,與擬南芥AtMAF2編碼氨基酸相似性為72%。亞細胞定位結(jié)果顯示BcMAF2蛋白不僅位于細胞核,在細胞質(zhì)、細胞膜中均有分布。以'NHCC004'為材料,通過qRT-PCR分析BcMAF2及其同源基因在持續(xù)5周低溫(4℃)處理過程中的表達量變化:BcMAF2基因在低溫處理第14 d表達水平明顯上調(diào);BcFLC2的表達量隨春化處理時間的延長而逐漸降低,但在14～28d表達量幾乎不變;BcMAF3基因?qū)Φ蜏仨憫蠲舾?整個低溫處理階段表達水平明顯高于對照,在第28 d達到表達高峰;BcFLM與BcMAF4的表達水平呈現(xiàn)“低～高～低”的動態(tài)變化,處理結(jié)束時表達量都低于春化前水平。2.誘餌載體pGBKT7-BcMAF2表達產(chǎn)物對酵母細胞無自激活和自毒性。BcMAF2蛋白與BcSVP蛋白在體內(nèi)和體外均存在相互作用。BcMAF2蛋白還可以與BcFLC2蛋白互作;BcMAF4可形成同源二聚體;擬南芥中AtMAF3可分別與AtFLM、AtMAF4、AtFLC互作,但不結(jié)球白菜并無此現(xiàn)象,說明BcMAF3蛋白可能在影響蛋白互作的關鍵氨基酸位點存在某些化學修飾或突變,阻止蛋白相互作用,有待后續(xù)研究;BcSVP可以和BcMAF3外的其它蛋白兩兩互作,且自身可形成同源二聚體。3.利用亞細胞定位技術研究BcFT的空間表達,發(fā)現(xiàn)BcFT蛋白在整個細胞中均有分布。構建酵母雙雜交誘餌載體pGBKT7-BcFT,驗證其表達產(chǎn)物對酵母細胞無自激活和自毒性;對不結(jié)球白菜酵母雙雜交cDNA文庫進行篩選,得到與BcFT互作的兩個蛋白BcPPD5和BcVHA-E1。對篩選得到的兩個蛋白進行生物信息學分析,預測二者均是親水性蛋白,不含信號肽,BcPPD5蛋白的氨基酸序列存在一個跨膜區(qū),二級結(jié)構中不規(guī)則卷曲所占比例最大,163～296氨基酸殘基之間存在一個PsbP結(jié)構域;BcVHA-E1蛋白無跨膜區(qū),二級結(jié)構中α螺旋所占比例最大,無特定結(jié)構域。
【學位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S634.3
【圖文】：

不結(jié)球白菜開花基因尸２的低溫應答及ｇｃＦｒ的互作蛋白篩選的分子式為Ｃ９２５Ｈ１５５２Ｎ２７0０３0５Ｓ５，含有１９２個氨基酸，相對分子質(zhì)量為２１．５ｘ點為６．２２，其中包含正電殘基（Ａｓｐ＋Ｇｌｕ）邋２８個，負電殘基（Ａｒｇ＋Ｌｙｓ）邋白的不穩(wěn)定系數(shù)為５８．１４，脂肪系數(shù)為９７．４０，平均親水性系數(shù)為－０．４９６。Ｐ酸疏水性圖譜（圖１－１－Ａ）顯示該蛋白的Ｃ端和Ｎ端都偏向親水性，中間疏水性交替出現(xiàn)，總體而言親水性表現(xiàn)更強。ＤＡＳ、ＰｒｅｄｉｃｔＰｒｏｔｅｉｎ預測區(qū)域。根據(jù)ＢｃＭＡＦ２的氨基酸序列，利用ＳＯＰＭＡ進行二級結(jié)構預測，，ＢｃＭＡＦ２蛋白中ａ螺旋所占比例最大，為４９．４８％；不規(guī)則卷曲結(jié)構次２３．９６％邋；邋ｐ轉(zhuǎn)角所占比例最少，僅為８．３３％。ＰｒｅｄｉｃｔＰｒｏｔｅｉｎ預測６９？１０６及１７１？１８７氨基酸之間，富集蛋白結(jié)合位點，可能是蛋白互作的關鍵區(qū)域。該蛋白１？６０個氨基酸殘基之間存在一個ＭＡＤＳ結(jié)構域（圖１－１－Ｂ）。ＭＡ白通常形成二聚體，以保守的ＭＡＤＳ結(jié)構域結(jié)合下游基因ＤＮＡｒＧ－ｂｏｘ，實現(xiàn)其調(diào)控功能。逡逑

Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ邋ｓｑ邋ｇ邐ｓ邋ｎ邋ｓｇ邋ｅｔｌｐｌｌ逡逑圖２－３邋／ＩｒＭ／ｍ和５ｃＡ＾Ｆ２氨基酸序列同源性比較逡逑Ｆｉｇ．邋２－３邋Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ邋ｏｆ邋ａｍｉｎｏ邋ａｃｉｄ邋ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ邋ｏｆ邋ＡｔＭＡＦ２邋ａｎｄ邋ＢｃＭＡＦ２逡逑在擬南芥中，ＪＭＭＦ２有５個同源基因，Ｊ／ＦＺＪｌ／、其逡逑中／ｉｒＦＬＭ位于染色體Ｉ，ＡＦＺＣ位于染色體Ｖ邋，邐在染色體Ｖ上串聯(lián)逡逑重復排列，形成一個２２－ｋｂ的基因簇。這些基因形成一個小的基因家族，在調(diào)控開花逡逑過程中行使各自的功能。與此相似，不結(jié)球白菜的同源基因有逡逑ＢｃＦＬＣｌ？ＢｃＦＬＣ３、ＢｃＦＬＭ、ＢｃＭＡＦ３、ＢｃＭＡＦ４，Ｘｉａｏ（２Ｑ＼３、ｉＫ為邋ＢｒＦＬＣ２邋是＆菜邋４邋個逡逑５ｒＦＬＣ＾基因中調(diào)控開花的關鍵基因，在不結(jié)球白菜中對應的是５ｃｆＺＣ２。利逡逑用ＤＮＡＭＡＮ８．０軟件分析這些同源基因的進化關系，結(jié)果如圖１－４，與逡逑最先聚類

邐１４０邐１６８逡逑圖２－２邋ＢｃＭＡＦ２蛋白二級結(jié)構預測逡逑藍色表示ｏｔ螺旋，綠色表示ｐ轉(zhuǎn)角，紅色表示延伸鏈，紫色表示不規(guī)則卷曲逡逑Ｆｉｇ．邋２－２邋Ｓｅｃｏｎｄａｒｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ＢｃＭＡＦ２邋ｐｒｏｔｅｉｎ逡逑Ｂｌｕｅ邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ邋ｆｏｒ邋ａｌｐｈａ邋ｈｅｌｉｘ，邋ｇｒｅｅｎ邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ邋ｆｏｒ邋ｂｅｔａ邋ｔｕｒｎ，邋ｒｅｄ邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ邋ｆｏｒ逡逑ｅｘｔｅｎｄｅｄ邋ｓｔｒａｎｄ，邋ｐｕｒｐｌｅ邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ邋ｆｏｒ邋ｒａｎｄｏｍ邋ｃｏｉｌ逡逑２．２邋ＢｃＭＡＦ２氨基酸序列同源性比較及同源基因進化分析逡逑下載擬南芥序列（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．ｏｒｇ／ｉｎｄｅｘ．ｊｓｐ），對擬南芥和不結(jié)逡逑球白菜Ｍ４Ｆ２的氨基酸序列進行同源性比較，結(jié)果如圖１－３，二者氨基酸序列相似度逡逑為７２％

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本文編號：2763433