【摘要】：根據(jù)果肉質(zhì)地的不同將桃分為溶質(zhì)型(Melting flesh,MF)、不溶質(zhì)型(Non-melting flesh,NMF)和硬質(zhì)型(Stony hard,SH)三種類型。溶質(zhì)型桃果實在成熟過程中生長素和乙烯均發(fā)生躍變,果實迅速變軟,不耐儲運,貨架期短;硬質(zhì)型桃果實在成熟過程中生長素和乙烯釋放量都維持在較低的水平,果實成熟后無論是掛樹還是采收均不變軟。本研究為闡明生長素和乙烯協(xié)同調(diào)控桃果實成熟的分子機制,以MF和SH兩種不同肉質(zhì)類型桃為實驗材料,篩選在兩種肉質(zhì)桃中表達差異顯著的生長素信號轉(zhuǎn)導關(guān)鍵響應因子AUX/IAA和乙烯響應因子(Ethylene responsive factor,ERF),并通過Y1H、EMSA、DLR、桃瞬時表達、Y2H、BiFC、pull-down等實驗研究AUX/IAA或ERFs調(diào)控桃成熟相關(guān)基因(PG、ACS、ACO、NCEDs等)表達的分子機制,以及AUX/IAA和ERFs之間的調(diào)控關(guān)系,進一步明確生長素和乙烯在桃果實成熟過程中的作用,為培育耐儲運、貨架期長的桃新品種奠定理論基礎(chǔ)。1.桃果實成熟相關(guān)ERFs篩選利用番茄的ERF蛋白在桃數(shù)據(jù)庫中Blastp ERFs轉(zhuǎn)錄因子,結(jié)合‘中油桃13’(CN13)和‘中油桃16’(CN16)果實成熟不同時期(S3、S4I、S4II、S4III)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),初步篩選到15個在CN13和CN16中的表達水平存在顯著差異的ERF轉(zhuǎn)錄因子。利用qRT-PCR進一步從15個候選ERFs轉(zhuǎn)錄因子中篩選到在MF和SH兩種果肉中表達存在顯著差異的7個ERF基因基因Prupe.1G037700(PpERF1)、Prupe.5G090800(PpERF2)、Prupe.7G194400(PpERF3)、Prupe.1G390800(PpERF4)、Prupe.5G061800(PpERF5)、Prupe.3G240000(PpERF6)、Prupe.2G289500(PpERF7)。2.PpERF2、PpERF3、PpERF4調(diào)控果實成熟相關(guān)基因表達通過轉(zhuǎn)錄組分析和qPCR驗證篩選到與候選ERFs基因和乙烯合成基因表達趨勢相似的ABA合成基因PpNCED2、PpNCED3和細胞壁降解相關(guān)基因PpPG1。在線預測發(fā)現(xiàn)在PpNCED2、PpNCED3、PpPG1啟動子上含有ERFs(CCGAC、A/GCCGAC、AA/TTTCAAA)結(jié)合元件和生長素響應元件(CCGACA、TGTCTC)。酵母單雜交和EMSA實驗結(jié)果表明PpERF2通過CCGAC元件直接結(jié)合PpNCED2、PpNCED3、PpPG1啟動子;PpERF3結(jié)合PpNCED2和PpNCED3啟動子;PpERF4通過CCGAC、AGCCGCC元件直接結(jié)合在PpNCED2、PpNCED3、PpPG1和PpACO1啟動子。煙草瞬時表達實驗結(jié)果表明PpERF2為轉(zhuǎn)錄抑制子;PpERF3和PpERF4為轉(zhuǎn)錄激活子。3.PpIAA1調(diào)控桃果實成熟軟化機理研究在桃基因組中鑒定到22個AUX/IAA,22個AUX/IAA基因中的一些基因在?CN13?中的表達水平明顯的高于在?CN16?中的表達,其中包括ppa010303(PpIAA1)基因。酵母單雜交和凝膠滯留(EMSA)實驗結(jié)果表明PpIAA1能通過CCGACA、TGTCTC、TGTG?TGTG元件分別結(jié)合在PpNCED2、PpPG1、PpNCED3、PpACS1啟動子上。瞬時表達實驗結(jié)果表明PpIAA1為轉(zhuǎn)錄激活子。酵母雙雜交、BiFC和pull-down結(jié)果表明PpERF4與PpIAA1互作。與野生型番茄相比,轉(zhuǎn)基因株系植株呈現(xiàn)出沒有分支、根系數(shù)目減少等性狀。轉(zhuǎn)基因株系番茄果實成熟早,且采后儲藏性降低。以上結(jié)果表明1)PpIAA1可直接結(jié)合PpACS1、PpNCED2、PpNCED3、PpPG1啟動子,并激活基因的表達。2)PpIAA1與PpERF4互作,并能進一步激活PpNCED2、PpNCED3、PpPG1基因的轉(zhuǎn)錄活性。3)PpERF4結(jié)合并促進PpIAA1的表達。通過PpIAA1和PpERF4之間合作的這3種機制,生長素和乙烯共同調(diào)控桃果實成熟和軟化。
【學位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S662.1
【圖文】：

圖 1-1 乙烯信號轉(zhuǎn)導(Liu et al 2015)。Fig. 1-1 ethylene signal transduction pathway (Liu et al 2015).1.2.2 生長素與果實成熟研究表明硬質(zhì)型桃中乙烯合成基因 PpACS1 的表達受到抑制是乙烯合成量低的原因（Tatsuki et al 2006）。最近的研究表明硬質(zhì)型桃中低濃度的生長素是抑制基因 PpACS1 表達的原因，因噴施外源萘乙酸（NAA），可以顯著的提高乙烯合成基因 PpACS1 的表達水平，乙烯產(chǎn)量明顯增加，果實變軟（Tatsuki et al 2013在植物器官中已經(jīng)研究了調(diào)節(jié)生長素動態(tài)平衡的多種機制，如生長素代謝載體依賴的細胞內(nèi)和細胞間生長素運輸（Rosquete et al 2012）。長時間以來，生長素被認為是果實成熟的負調(diào)控因子，因為在果實成熟期生長素的濃度很低（Nitsch 1952）。果實成熟初期生長素濃度的下降被認為是果實成熟期的必備條件（Given et al 1988，Chen et al 1999，Purgatto et al 2002，B ttcher et al 2010）噴施外源生長素使果實成熟延遲（Cohen 1996，Purgatto et al 2002，F(xiàn)abbroni et

Oetiker et al 1997，Nakatsuka et al 1998， Shiu et al 1998）。其中個基因在果實成熟過程中的表達模式不同：LeACS1A、LeACS2、LeACS4LeACS6（Barry et al 2000）。Barry 等（2000）提出了一個模型來解釋在番茄成過程中這些基因的不同調(diào)控模式（圖 1-2）（Serreze et al 2000）。簡而言之，在統(tǒng) 1 中，基因 LeACS6 起主要的作用，盡管基因 LeACS1A 在這些組織中也有達。在果實成熟轉(zhuǎn)化期，基因 LeACS1A 和 LeACS4 開始表達并且依賴于轉(zhuǎn)錄子 RIN MADS-box 的調(diào)控。隨著乙烯合成量的增多，基因 LeACS2 隨之也開始達，這就形成了系統(tǒng) 2 乙烯合成的自體調(diào)控模式。番茄中的 5 個 ACO（LeACO1-5），其中有 3 種酶在果實中的表達模式不同（LeACO1、LeACOLeACO4）（Blume et al 1997，Van-der-Hoeven et al 2002）�；� LeACO1 和 LeA在系統(tǒng) 1 中持續(xù)表達，但是在進入系統(tǒng) 2 時，其表達水平會顯著的增加。然而果實成熟過程中基因 LeACO1 和 LeACO4 的表達水平一直很穩(wěn)定。

EIN3 二聚體可以特異的結(jié)合于轉(zhuǎn)錄因子 ERF1 啟動子的上游的特定序列。EIN3 的兩個同源二聚體 EIL1 和 EIL2 同樣具有結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子 ERF1 啟動子特定序列的能力；在沒有乙烯存在的情況下，EIN3/EIL1 二聚體就會被兩個 F-box蛋白 EBF1/EBF2 通過泛素化而降解（Solano et al 1998，Guo et al 2003）。在乙烯存在的情況下，通過進入細胞核中的 EIN2 C 端的作用可以降解 EBF1/EBF2 二聚體，并穩(wěn)定 EIN3/EIL1 二聚體來響應乙烯應答基因（Potuschak et al 2003，An et al2010）。當用空氣處理時，CIR1 可以直接結(jié)合并磷酸化至少 EIN2-C 端的兩個位點Ser645（S645）和 S924（Wen et al 2012，Qiao et al 2012）。而乙烯可以使 CTR1失活，并失去使 EIN2 磷酸化的能力，這種去磷酸化的 EIN2 的 C 端就會斷裂并由細胞質(zhì)轉(zhuǎn)運至細胞核中，EIN2 的 C 端可以通過抑制二聚體 EBF1/EBF2 的泛素化活性來穩(wěn)定 EIN3/EIL1 二聚體并響應乙烯應答信號（Ju et al 2012）（圖 1-3）。

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前7條

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本文編號：2762048