【摘要】：銅鋅超氧化物歧化酶(CSD)是植物響應逆境脅迫過程中的關鍵酶,其含量和活性與植物抗逆性密切相關。CSD基因已在多種植物中完成了克隆與功能鑒定,而關于結縷草CSD基因的報道很少。本研究以結縷草cDNA為模板,利用同源克隆法,從結縷草轉錄組數據庫中獲得了結縷草ZjCSD1基因,該基因編碼一個含有152個氨基酸的蛋白質。生物信息學分析表明:ZjCSD1基因編碼蛋白為穩(wěn)定的、親水的、酸性、非分泌脂溶蛋白,含有CSD蛋白家族特有的保守結構域,具有典型的Cu2+和Zn2+結合位點;與小米、玉米等禾本科植物具有較高的同源性,親緣關系較近。亞細胞定位表明ZjCSD1蛋白定位于細胞質中。采用實時熒光定量PCR研究該基因在不同組織中、不同脅迫處理下的表達模式,結果表明:ZjCSD1基因在結縷草的根、莖和葉中都有表達,且葉中的表達量最高;干旱脅迫(30%PEG)、鹽脅迫(150 mM NaCl)和Cd2+脅迫(200 mg/l Cd2+)均能誘導ZjCSD1基因表達量上調,Pb2+脅迫(1 g/1 Pb2+)誘導ZyjCSSD1基因表達量下調。因此結縷草ZjCSD1基因響應干旱、鹽和重金屬脅迫。通過農桿菌介導法,在禾本科模式植物水稻中過表達ZjCSD1基因,成功獲得并鑒定了 102個轉基因水稻株系。轉基因子代的表型有待后續(xù)試驗探究。CSD的激活主要依賴于其銅分子伴侶蛋白,銅鋅超氧化物歧化酶銅分子伴侶蛋白(CCS)是一種胞內銅轉運蛋白,其功能是通過蛋白間相互作用,將銅離子運輸給CSD,進而激活CSD。在本實驗室前人研究的基礎上,本文通過RACE擴增得到了ZjCCS基因ORF前的75個堿基序列以及3種不同長度的3'-UTR序列,同時發(fā)現ZjCCS基因可以從兩個不同的轉錄起始位點開始轉錄。亞細胞定位分析表明ZjCCS全長蛋白定位于葉綠體,而去掉轉運肽的ZjCCS蛋白定位于細胞質。采用實時熒光定量PCR研究ZjCCS基因在結縷草不同組織中的表達模式,發(fā)現ZjCCS基因在根、莖和葉中都有表達,且葉中的表達量最高,根中的最低。通過農桿菌介導法,在水稻中過表達ZjCCS基因,成功獲得并鑒定了 30個轉基因水稻株系。轉基因子代的表型有待后續(xù)試驗探究。此外,通過酵母雙雜和BiFC證明了去掉葉綠體轉運肽的結縷草ZjCCS蛋白能夠與ZjCSD1蛋白在細胞質中互作,且ZjCCS第160～286個氨基酸區(qū)段在互作的過程中至關重要。綜上所述,本文對結縷草ZjCSD1和ZjCCS基因進行了克隆與功能初步研究,有利于進一步了解CSD和CCS基因在結縷草應對逆境脅迫過程中的作用,并為后期研究結縷草中CCS激活CSD的分子機制提供理論依據。
【學位授予單位】：北京林業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S688.4
【圖文】：

完成了基因組測序，因此被廣泛用于遺傳和分子研究。植物是復雜的多細胞生物，在逡逑運輸銅等必需微量營養(yǎng)素的過程中要通過較長的距離，且在到達靶位點之前需要跨越逡逑多個膜系統。如圖１－２所示，ＣＯＰＴ１是一種類Ｃｔｒ轉運蛋白，銅離子在ＣＯＰＴ１的作逡逑用下從質外體跨過細胞膜，進入細胞內，再由銅伴侶蛋白螯合或運輸至靶標。ＣＯＰＴ１逡逑７逡逑

２．３．２結縷草Ｚｙ‘ＣＳＺ）７基因編碼蛋白的理化性質與結構特征分析逡逑利用在線工具Ｐｒｏｔｐａｒａｍ預測ＺｙＣＳＴ）／基因編碼蛋白的基本理化性質，結果表明逡逑該蛋白相對分子量為１５．０８３６ｋＤ，分子式為Ｃ６４４Ｈｕ）２９Ｎ１９７０２１６Ｓ３，理論等電點５．７６。由逡逑１８種氨基酸組成，其中Ｇｌｙ占１９．７％，比例最高。蛋白質不穩(wěn)定指數為］４．５０邋（＞４０逡逑時不穩(wěn)定），脂溶指數為７７．６３，總平均疏水指數為－０．２５７。因此推測該蛋白是穩(wěn)定的、逡逑酸性、親水脂溶蛋白。利用ＴＭＨＭＭ２．０在線工具預測ＺｊＣＳＤ］蛋白的跨膜結構域，逡逑結果表明ＺｊＣＳＤｌ蛋白無跨膜螺旋，整條肽鏈都位于膜外；利用在線工具ＳｉｇｎａｌＰ邋４．１逡逑對ＺｊＣＳＤｌ蛋白的信號肽進行預測，結果顯示ＺｊＣＳＤｌ蛋白Ｎ端不含信號肽，為非分逡逑泌蛋白；利用ＴａｒｇｅｔＰ邋１．１對ＺｊＣＳＤｌ蛋白進行亞細胞定位預測，結果表明ＺｊＣＳＤｌ蛋逡逑白位于細胞質中。綜上推測ＺｊＣＳＤｌ蛋白是位于細胞質中的非分泌蛋白。逡逑２．３．３結縷草Ｚｙ＿Ｃ５Ｄ７基因編碼氨基酸序列同源性與系統進化分析逡逑在ＮＣＢＩ中，利用Ｂｌａｓｔ檢索并下載與結縷草ＺｙＣＳＤＹ基因編碼的氨基酸序列相逡逑似性較高的序列，在ＤＮＡＭＡＮ中進行比對。結果表明，ＺＪＣＳＤ／基因編碼的氨基酸逡逑序列與玉米中的相似性達９１％，與二穗短柄草、獐茅、歐洲大葉楊等相似性達逡逑８５°／。？８９％。另外，ＣＳＤ蛋白的不同氨基酸區(qū)段序列保守程度不同，Ｃ端序列較Ｎ端逡逑

圖２－５邋ＺｊＣＳＤｌ蛋白與其他物種ＣＳＤ蛋白氨基酸序列的系統進化樹分析；節(jié)點處的數字表示逡逑ｂｏｏｔｓｔｒａｐ驗證重復１０００次該節(jié)點可信度的百分比逡逑Ｆｉｇ．２－５邋Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ邋ｔｒｅｅ邋ｏｆ邋ＺｊＣＳＤｌ邋ａｎｄ邋ＣＳＤ邋ｆｒｏｍ邋ｏｔｈｅｒ邋ｓｐｅｃｉｅｓ．邋Ｔｈｅ邋ｎｕｍｂｅｒ邋ｏｎ邋ｔｈｅ邋ｂｒｕｎｃｈ邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ逡逑ｔｈｅ邋ｒｅｌｉａｂｉｌｉｔｙ邋ｐｅｒｃｅｎｔ邋ｏｆ邋ｂｏｏｔｓｔｒａｐ邋ｖａｌｕｅ邋ｂａｓｅｄ邋ｏｎ邋１０００邋ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．逡逑２２逡逑

【參考文獻】

相關期刊論文 前2條

1 馮勛偉;才宏偉;;結縷草CBF基因的同源克隆及其轉基因擬南芥的抗寒性驗證[J];作物學報;2014年09期

2 張玉秀;金玲;馮珊珊;劉金光;柴團耀;;鎘對鎘超累積植物龍葵抗氧化酶活性及基因表達的影響[J];中國科學院研究生院學報;2013年01期

相關博士學位論文 前3條

1 荊曉姝;秋茄葉綠體抗氧化防御基因KcCSD和KcTrxf的耐鹽性功能分析[D];北京林業(yè)大學;2015年

2 許立新;草地早熟禾適應干旱以及干旱后復水恢復機理研究[D];北京林業(yè)大學;2011年

3 王舟;結縷草（Zoysia japonica）抗寒相關轉錄因子ZjDREB1基因的克隆、表達模式及功能分析[D];南京農業(yè)大學;2010年

相關碩士學位論文 前2條

1 樊波;結縷草中鹽脅迫響應基因的克隆與功能研究[D];北京林業(yè)大學;2016年

2 石鵬;干旱預處理誘導白三葉抗旱性的生理機制與抗氧化酶基因差異表達[D];四川農業(yè)大學;2012年

本文編號：2761481