【摘要】：獼猴桃果實(shí)維生素C含量高,具有均衡的礦物質(zhì)營(yíng)養(yǎng)、膳食纖維和利于人體健康的代謝物組分,被譽(yù)為“水果之王”。果皮毛是影響獼猴桃外觀品質(zhì)和消費(fèi)的因素之一,果實(shí)少毛或無毛是獼猴桃育種的主要目標(biāo)之一。本論文以‘紅陽(yáng)’獼猴桃(Actinidia chinensis cv.‘Hongyang’)、毛花獼猴桃(Actinidia eriantha)、和山梨獼猴桃(Actinidia rufa)為材料,基于獼猴桃二代和三代轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),篩選出2個(gè)調(diào)控獼猴桃表皮毛發(fā)育的候選基因并在六倍體美味獼猴桃‘海沃德’(Actinidia deliciosa‘Hayward’)中進(jìn)行基因編輯研究,以篩選出調(diào)控獼猴桃表皮毛發(fā)育的基因,為基因編輯育種奠定基礎(chǔ)。本試驗(yàn)主要結(jié)果如下:1.以AtGL1、AtGL2、AtGL3、AtTTG1和AtSAD2等5個(gè)調(diào)控?cái)M南芥表皮毛起始和發(fā)育的基因?yàn)槟０?基于獼猴桃基因組數(shù)據(jù)庫(kù),通過比對(duì)獲得了相應(yīng)的同源基因,通過蛋白質(zhì)序列比對(duì)和進(jìn)化樹的構(gòu)建和分析,分別獲得了AtGL1的候選基因Achn116791,AtGL2的候選基因Achn198951,AtGL3的候選基因Achn244201、Achn302211和Achn071731,AtTTG1的候選基因Achn045741,AtSAD2的候選基因Achn379131和Achn379141。分析了上述候選基因在紅陽(yáng)獼猴桃、毛花獼猴桃和山梨獼猴桃的幼果、成熟葉和莖尖的表達(dá)水平以及在紅陽(yáng)獼猴桃果實(shí)不同發(fā)育階段的表達(dá)水平。最后篩選出了2個(gè)調(diào)控獼猴桃表皮毛發(fā)育的候選基因:AtGL1的候選基因Achn116791和AtGL3的候選基因Achn302211,而基因AtSAD2的候選基因Achn379131可能不是調(diào)控獼猴桃表皮毛發(fā)育的關(guān)鍵基因。2.選取候選基因Achn116791,Achn302211和Achn379131為目標(biāo)基因,利用軟件CRISPRdirect,根據(jù)sgRNA設(shè)計(jì)的原則,對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行sgRNA設(shè)計(jì),成功構(gòu)建了目標(biāo)基因的CRISPR/Cas9基因編輯載體,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化海沃德獼猴桃葉盤。經(jīng)抗性篩選和PCR鑒定,我們獲得了16個(gè)獼猴桃Achn116791轉(zhuǎn)基因株系,經(jīng)測(cè)序分析有9個(gè)株系發(fā)生了堿基的插入、缺失或替換。通過葉片表皮毛的觀察,4號(hào)、5號(hào)和6號(hào)株系的葉片表皮毛密度降低、長(zhǎng)度變短;我們獲得了4個(gè)獼猴桃Achn302211轉(zhuǎn)基因株系,其中1個(gè)株系發(fā)生了堿基的插入,引起了葉片表皮毛密度降低、長(zhǎng)度變短;我們獲得了4個(gè)獼猴桃Achn379131轉(zhuǎn)基因株系,但均未檢測(cè)到靶位點(diǎn)被編輯。這些結(jié)果不僅說明Achn116791基因和Achn302211基因調(diào)控著獼猴桃葉片表皮毛的發(fā)育,也證實(shí)了在六倍體海沃德獼猴桃中可以利用CRISPR/Cas9技術(shù)進(jìn)行基因編輯,且在本試驗(yàn)轉(zhuǎn)基因株系中基因編輯效率為41.7%。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S663.4

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本文編號(hào)：2761167