發(fā)布時(shí)間：2020-07-17 21:05

【摘要】：抗菌肽在農(nóng)業(yè)、食品、醫(yī)療等領(lǐng)域中具有較高的應(yīng)用價(jià)值,因此被越來越多的研究人員所關(guān)注。篩選這些肽及其編碼基因的傳統(tǒng)技術(shù)較為繁瑣,并且篩選到新編碼基因的概率較低。本研究針對(duì)上述問題,利用枯草芽孢桿菌分泌表達(dá)系統(tǒng),建立了一種全新高效的抗菌肽篩選策略。本研究利用枯草芽孢桿菌系統(tǒng)建立大蒜cDNA表達(dá)文庫,與本實(shí)驗(yàn)室保存的大腸桿菌系統(tǒng)大蒜cDNA表達(dá)文庫一起評(píng)估文庫質(zhì)量并進(jìn)行后續(xù)篩選。以抗菌蛋白對(duì)宿主細(xì)胞的傷害作為指標(biāo),初步篩選在胞內(nèi)具有抑菌活性的蛋白�？莶菅挎邨U菌系統(tǒng)篩選到53個(gè)候選抗菌蛋白,大腸桿菌系統(tǒng)篩選到170個(gè)候選抗菌蛋白。通過掃描電子顯微鏡觀察到,候選抗菌蛋白的菌體均表現(xiàn)出破損或縮皺的現(xiàn)象。提取上述候選抗菌蛋白的粗蛋白,在體外測(cè)試抑菌活性,結(jié)果表明,枯草芽孢桿菌系統(tǒng)大蒜cDNA文庫篩選出11個(gè)具有廣譜抑菌活性的肽,經(jīng)測(cè)序均為未經(jīng)過報(bào)道的基因。而大腸桿菌系統(tǒng)只篩選出1個(gè)具有抑菌活性的肽。因此,經(jīng)過兩個(gè)篩選系統(tǒng)的對(duì)比,證實(shí)了枯草芽孢桿菌系統(tǒng)篩選抗菌肽更加的高效、穩(wěn)定。利用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)抗菌肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)、等電點(diǎn)、分子質(zhì)量等性質(zhì),根據(jù)二級(jí)結(jié)構(gòu)將肽分成四類,結(jié)合抑菌數(shù)據(jù),推測(cè)同時(shí)具有α-螺旋和β-折疊的這類肽具有較好的抑菌活性。為了探究抗菌肽的應(yīng)用潛能,對(duì)抗菌肽進(jìn)行溶血實(shí)驗(yàn)與熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn),結(jié)果證實(shí),在肽濃度高達(dá)1000μg/mL時(shí)溶血活性基本低于5%,并且部分肽在100℃高溫下仍具有一定的抑菌活性。在離體的煙草葉片上涂抹抗菌肽,能夠不同程度的抑制辣椒疫霉侵染。將純化后的抗菌肽AsR416處理細(xì)菌細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)細(xì)菌的細(xì)胞膜受到了損傷,說明篩選到的抗菌肽能夠破壞細(xì)胞膜的完整性。綜上所述,本研究提供了一種新穎、靈敏且高通量分離抗菌基因的策略,并篩選到11個(gè)具有廣譜抗性的新基因。根據(jù)本文的研究結(jié)果,植物和人類病原細(xì)菌、真菌甚至是癌細(xì)胞都有作為此篩選策略中靶標(biāo)指示物的可能性,以達(dá)到針對(duì)性的篩選特異抗性基因的目的。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S633.4
【圖文】：

利用枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行大蒜抗菌基因篩選及功能研究anne and Harwood 2010)。信號(hào)肽通常由較短的氨基酸組成，并在蛋白目的地后會(huì)立即被特異性信號(hào)肽酶和信號(hào)肽肽酶（SPP 酶）去除和降合成后通過不同的機(jī)制運(yùn)輸?shù)侥康牡?Westers et al 2015)。為了適應(yīng)不，枯草芽孢桿菌進(jìn)化出了幾種途徑來滿足這一要求：一般蛋白質(zhì)分，雙精氨酸途徑（Tat）和 ATP 結(jié)合盒（ABC）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（圖 1-3）。

還有其他提高分泌效率的方法（圖1-4）。例如，人為制造缺失蛋白酶的菌株，去除不必要的基因組序列(Kenji et al 2011,Manabe et al 2013)，或者優(yōu)化代謝工程技術(shù)等等。通過基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的結(jié)合，利用合成生物學(xué)的方法可以改善工業(yè)中蛋白質(zhì)的生產(chǎn)。

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本文編號(hào)：2759937