【摘要】：GRPs(Glycine-rich proteins,富含甘氨酸蛋白),一類結構簡單,且富含甘氨酸的高度重復序列組成的一個大家族蛋白,其在植物生長發(fā)育、生物防御、非生物脅迫響應等過程中起著重要作用。課題組前期發(fā)現一個在pol型細胞質雄性不育和可育植株花蕾中存在表達差異的基因BrGRP1,且在不育花蕾中表達量較高。本試驗主要通過cDNA文庫構建和篩選、BrGRP1過表達載體構建及遺傳轉化、轉基因植株抗逆性鑒定等研究,初步揭示該基因的生物學功能。主要研究結果如下:(1)以大白菜不育系16C14花蕾為試驗材料,采用SMART(switching mechanism at 5' end of RNA transcript)技術合成 cDNA,利用 DSN(duplex-specific nuclease)對所得cDNA進行均一化處理,之后與pDONRTM/Zeo載體重組并轉化DH10B大腸桿菌菌株,構建了大白菜pol型雄性不育花蕾均一化cDNA文庫。經檢測,文庫滴度為3.2×106 cfu/mL,庫容量約為1.28×10 cfu,重組率97%,插入片段平均大小1.2kb左右。隨機挑選100個陽性菌斑進行測序,冗余度僅為3.7%。(2)以文庫質粒為模板,利用特異引物GRP-F/R成功克隆到BrGRP1基因cDNA序列。序列分析表明BrGRP1基因完整的ORF(Open Reading Frame,開放閱讀框)為804 bp,編碼267個氨基酸,分子量為29.7 kDa,等電點為7.3;其編碼的BrGRP1蛋白為非跨膜蛋白,也不是分泌蛋白。與白菜基因組預測基因Bra004066序列相似性為93%,擬南芥At1G6787 基因的相似性為65%。(3)利用無縫克隆技術成功構建過表達載體Cam35S-BrGRP1,進一步進行擬南芥遺傳轉化。通過抗生素抗性篩選和PCR鑒定共獲得7個擬南芥轉基因純系,從中隨機選取了三個轉基因T3代純系(GRP1,GRP4和GRP5)進行后續(xù)試驗。與野生型相比,轉基因擬南芥在表型上沒有發(fā)生變化;qRT-PCR分析表明BrGRP1在轉基因擬南芥中高效表達。逆境響應研究表明:0.3μmmol/LABA、100 mmol/LNaCl處理可抑制轉基因擬南芥種子萌發(fā)和幼苗生長。以上結果表明該BrGRP1基因可能參與ABA信號轉導過程及NaCl脅迫響應過程。
【學位授予單位】：山西農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S634.1
【圖文】：

２．３．１總ＲＮＡ提取及質量檢測逡逑以／？0／型大白菜雄性不育系１６Ｃ１４不育花蕾為材料，提取總ＲＮＡ，經電泳檢測，逡逑有２８Ｓ和１８Ｓ兩條帶，且條帶完整，沒有彌散，亮度之比約為２：１邋（圖２－１）；同時用核酸逡逑儀測定ＯＤ２６０／２８０為２．０３和２．０５，說明所提取的總ＲＮＡ的質量較好，符合文庫構建的要逡逑求。逡逑＾—邋２ＳＳ邋ｒＲＮ＇Ａ逡逑＾ＩＳＳ逡逑圖２－１大白菜雄性不育系花蕾總ＲＮＡ電泳圖逡逑１、２均代表總ＲＮＡ，二次重復。逡逑Ｆｉｇ．２－１邋Ｇｅｌ邋ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｏｆ邋ｔｏｔａｌ邋ＲＮＡ邋ｏｆ邋ＣＭＳ邋ｆｌｏｗｅｒｓ邋ｉｎ邋Ｃｈｉｎｅｓｅ邋ｃａｂｂａｇｅ逡逑１邋ｎ邋２，邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ邋ｔｏｔａｌ邋ＲＮＡ逡逑－１２－逡逑

２．３．１總ＲＮＡ提取及質量檢測逡逑以／？0／型大白菜雄性不育系１６Ｃ１４不育花蕾為材料，提取總ＲＮＡ，經電泳檢測，逡逑有２８Ｓ和１８Ｓ兩條帶，且條帶完整，沒有彌散，亮度之比約為２：１邋（圖２－１）；同時用核酸逡逑儀測定ＯＤ２６０／２８０為２．０３和２．０５，說明所提取的總ＲＮＡ的質量較好，符合文庫構建的要逡逑求。逡逑＾—邋２ＳＳ邋ｒＲＮ＇Ａ逡逑＾ＩＳＳ逡逑圖２－１大白菜雄性不育系花蕾總ＲＮＡ電泳圖逡逑１、２均代表總ＲＮＡ，二次重復。逡逑Ｆｉｇ．２－１邋Ｇｅｌ邋ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｏｆ邋ｔｏｔａｌ邋ＲＮＡ邋ｏｆ邋ＣＭＳ邋ｆｌｏｗｅｒｓ邋ｉｎ邋Ｃｈｉｎｅｓｅ邋ｃａｂｂａｇｅ逡逑１邋ｎ邋２，邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ邋ｔｏｔａｌ邋ＲＮＡ逡逑－１２－逡逑

邐＾＾ａａｌ邋（５５４３）逡逑Ｘｈｏｌ邋（８９０６）ＬＢ邋ＡｐａＵ（６９８８？逡逑圖３－１邋Ｃａｍ３５Ｓ－ＢｒＧＲＰ］過表達載體的構建逡逑Ｆｉｇ．３－１邋Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ邋ｏｔ＇Ｃａｍ３５Ｓ－ＢｒＧＲＰｌ邋ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｖｅｃｔｏｒ逡逑②轉化液的配置逡逑配制１／２邋ＭＳ轉化緩沖液，所包含成分及用量具體見表３－８：逡逑表３－８邋１／２邋ＭＳ轉化緩沖液體系逡逑Ｔａｂｌｅ邋３－８邋Ｓｙｓｔｅｍ邋ｏｆ邋１／２邋ＭＳ邋ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ邋ｂｕｆｆｅｒ逡逑成分邐使ＨＪＭ逡逑Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ邐Ａｍｏｕｎｔ逡逑ＭＳ邋干粉邐２．３５ｇ逡逑蔗糖邐５０．０ｇ逡逑６－ＢＡ（ｌｍｇ／ｍＬ）邐１０．０邋｜ｊ．Ｌ逡逑Ｓｉｌｗｅｔｔ－７７邐４００邋｜ｉＬ逡逑乙酰ｒ香酮邐１０（ＨｉＬ逡逑邐蒸餾水定容至邐ＩＬ邐逡逑將檢測陽性的農桿菌陽性菌液以１：１２５稀釋于２５０邋ｍｌ大瓶培養(yǎng)基中，２８°Ｃ，邋２００邋ｒｐｍ逡逑培養(yǎng)至00６00約為0．８；之后將菌液４１＾，５邋００0１＾１１１離心５邋１１１丨１１，收集菌體；最后，將逡逑菌體重懸浮于新鮮配制的轉化緩沖液中，至終濃度0Ｄ６（Ｗ值為０．６－０．８，并用ＮａＯＨ溶逡逑液調ｐＨ至５．８

【相似文獻】

相關碩士學位論文 前1條

1 李真真;大白菜富含甘氨酸蛋白BrGRPl的功能初探[D];山西農業(yè)大學;2018年

本文編號：2758700